LBD14基因调控木材材性

本发明涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，本发明涉及lbd14基因调控木材材性。

背景技术：

1、维管组织中，木质部中的导管、管胞主要负责水分和矿物质由下向上的纵向运输；而韧皮部中的筛管、伴胞则可将蔗糖等光合作用产物从叶片或其他光合作用部位向下运输。此外，除了这些纵向的运输系统之外，具有次生维管组织的植物还进化出了水平方向的径向运输系统，即主要由射线薄壁细胞组成的射线。射线作为横跨整个维管组织的结构，其在水分及养分的存储和径向运输、气体的径向运输、切口不定根的形成以及响应机械损伤和防御等方面具有重要作用，并且其也参与次生生长，影响木材的机械强度。虽然，人们对于射线的功能有了初步的认识，然而关于射线更为详细的功能以及射线发育的过程仍知之甚少，对于其背后所潜在的分子调控机制的了解仍存在相当大的空白。射线薄壁细胞一般镶嵌分布于纤维细胞与导管之间，并且缺乏确切的射线薄壁细胞标记基因，因而较难将其分离出来，也阻碍了对射线相关功能的探索，限制了对调控射线相关功能基因的进一步挖掘。因此，鉴定射线薄壁细胞特异表达的标记基因，将有力推动对射线薄壁细胞功能的进一步探索，揭示不同基团在射线薄壁细胞中所扮演的角色，解析射线薄壁细胞发育以及功能实现的具体分子机制。同时，射线薄壁细胞标记基因的鉴定也为林木基础研究和林业产业发展提供了重要的遗传材料和工具。

2、lbd转录因子是指一类编码含有lateral organ boundaries(lob)保守结构域蛋白的基因，lob保守结构域通常位于蛋白序列的n端，主要包含3个保守基序：c-block、gas-block以及leucine-zipper-like coiled-coil。lob结构域作为lbd功能执行的主要结构，其能特异的结合基因启动子区域中某一序列，进而调控基因的表达。lbd转录因子是植物所特有的转录因子家族，并广泛存在于植物中,其在调控高等植物生长及代谢过程中显示出高度的功能多样性，除了在侧生器官边界的确定起着非常重要的作用，还参与调控叶片发育、花序发育、胚胎发育、侧根的形成、维管的形成以及代谢等过程。然而，关于lbd在参与调控射线薄壁细胞的生长发育以及相关生物学功能的实现，目前仍无相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明首次在杨树木质部中鉴定到一个特异表达定位在射线薄壁细胞的标记基因pdlbd14，并首次解析了射线薄壁细胞影响邻近细胞次生壁加厚的分子机制。

2、本发明提供一种核酸构建物，包含：

3、(1)编码lbd14蛋白的核酸序列，或

4、(2)特异性干扰lbd14基因转录和/或表达的核酸序列。

5、在一个或多个实施方案中，lbd14基因是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14基因(pdlbd14基因)。

6、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

7、在一个或多个实施方案中，pdlbd14基因序列如seq id no:2或与其具有至少80％相同性的序列所示。

8、在一个或多个实施方案中，所述pdlbd14蛋白的氨基酸序列如seq id no:3或与其具有至少80％相同性的序列所示。

9、在一个或多个实施方案中，pdlbd14基因序列号为potri.013g156200。

10、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含与核酸序列操作性连接的启动子(如seq id no:1所示的启动子序列)。

11、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物从5’至3’具有下述元件：启动子(如seq id no:1所示的启动子序列)、编码lbd14蛋白的核酸序列、和终止子。

12、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物从5’至3’具有下述元件：启动子(如35s启动子)、编码lbd14蛋白的核酸序列、ear基序和终止子。

13、在一个或多个实施方案中，ear基序包含lxlxl，x是任意氨基酸。优选地，ear基序包含(ldldlelrlgfa)n，n是1-10的整数，优选n是4。在一个或多个实施方案中，ear基序如seq id no:4所示。

14、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。优选地，所述核酸构建物为表达载体或整合载体。更优选地，所述核酸构建物为pdlbd14pro::pdlbd14载体。

15、本发明提供一种遗传工程化的宿主细胞，其

16、(1)表达、包含或分泌lbd14蛋白，或

17、(2)包含本文任一实施方案所述的核酸构建物。

18、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞不是植物细胞。

19、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

20、本发明提供一种lbd14的用途，用于在植物中特异定位细胞。

21、在一个或多个实施方案中，所述细胞为射线薄壁细胞。

22、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨柳科植物。

23、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨属植物。

24、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨树。

25、在一个或多个实施方案中，所述lbd14是一种核定位蛋白。

26、在一个或多个实施方案中，所述lbd14具有转录激活活性。

27、在一个或多个实施方案中，所述lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

28、本发明还提供一种在植物中特异定位细胞的方法，所述方法包括：定位植物中lbd14。

29、在一个或多个实施方案中，所述细胞为射线薄壁细胞。

30、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨柳科植物。

31、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨属植物。

32、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨树。

33、在一个或多个实施方案中，所述lbd14是一种核定位蛋白。

34、在一个或多个实施方案中，所述lbd14具有转录激活活性。

35、在一个或多个实施方案中，所述lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

36、本发明提供一种lbd14用途，用于调控植物植株性状、植物木质素合成、植物细胞壁厚度(木质部导管细胞壁和/或纤维细胞壁)、植物中pdcb5的表达、植物中胼胝质的沉积、植物胞间连丝通透性、和/或植物中细胞间物质运输。

37、在一个或多个实施方案中，所述用途为：

38、(1)上调lbd14的表达或活性，从而(i)使植株相比于野生型植株株高变矮、节间长度变短、茎干变细和茎干强度变低，(ii)抑制木质素合成，(iii)使木质部导管细胞壁变厚和/或纤维细胞壁变薄，(iv)上调pdcb5的表达，(v)促进植物中胼胝质在胞间连丝的沉积，(vi)抑制胞间连丝通透性，和/或(vii)阻碍细胞间物质运输；或

39、(2)下调lbd14的表达或活性，从而(i)使植株相比于野生型植株株高变高、节间长度变长和茎干变粗，(ii)使木质部导管细胞壁变薄和(iii)抑制植物中胼胝质在胞间连丝的沉积、(iv)促进胞间连丝通透性，和/或(v)促进细胞间物质运输。

40、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中lbd14蛋白表达或活性包括：将lbd14蛋白的编码序列转入植物，获得转化的植物。

41、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中lbd14蛋白表达或活性包括：将核酸构建物转入植物，所述核酸构建物从5’至3’具有下述元件：启动子(如seq id no:1所示的启动子序列)、编码lbd14蛋白的核酸序列、和终止子。

42、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中lbd14蛋白表达或活性包括：

43、(1)特异性干扰lbd14基因转录和/或表达，

44、(2)下调lbd14蛋白活性，

45、(3)在植物中表达活性降低的lbd14蛋白，或

46、(4)在植物中表达与ear基序操作性连接的lbd14蛋白；优选地所述ear基序位于lbd14蛋白的n端或c端。

47、在一个或多个实施方案中，(1)所述干扰为干扰lbd14基因的转录或其转录本的翻译。

48、在一个或多个实施方案中，(2)所述下调包括在植物中：

49、(i)表达能够下调lbd14蛋白活性的lbd14蛋白的特异性抗体或配体(例如抑制型抗体)，或

50、(ii)导入编码(i)的核酸序列和/或能表达(i)的核酸构建物。

51、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中lbd14蛋白中的表达包括：将特异性干扰lbd14因转录和/或表达的核酸转入植物，获得转化的植物。

52、在一个或多个实施方案中，特异性干扰lbd14基因转录和/或表达的核酸选自下组：(1)以lbd14基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna、shrna、rerna、sgrna，或(2)能表达或形成(1)的构建物。

53、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(i)和项目(2)中(i)所述野生型植株节间长度平均为1.43cm，茎干直径平均为0.32cm，茎干强度为3.7n/cm2。

54、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(i)所述植株在节间长度上缩短了32％，茎干直径减少了7％-12％，茎干强度降低了66％-76％。

55、在一个或多个实施方案中，项目(2)中(i)所述植株在节间长度增加了35％-80％，茎干直接增加了9％-16％。

56、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(ii)所述木质素优选为s-木质素。

57、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(ii)所述编码木质素合成相关酶的基因包括ptr4cl3/5、ptrpal2/5和/或ptrcald5h。

58、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(iii)和项目(2)中(ii)所述细胞壁为细胞次生壁。

59、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(vi)和项目(2)中(iv)所述胞间连丝为射线薄壁细胞与纤维细胞之间胞间连丝。

60、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(vii)和项目(2)中(v)所述细胞间物质运输为射线薄壁细胞和纤维细胞间的物质运输。

61、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨柳科植物。

62、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨属植物。

63、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨树。

64、在一个或多个实施方案中，lbd14能够直接结合到pdcb5的启动子，从而激活其表达。

65、在一个或多个实施方案中，lbd14基因是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14基因(pdlbd14基因)。

66、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

67、在一个或多个实施方案中，所述pdlbd14蛋白的氨基酸序列如seq id no:3或与其具有至少80％相同性的序列所示。

68、在一个或多个实施方案中，编码pdlbd14蛋白的核酸序列如seq id no:2或与其具有至少80％相同性的序列所示。

69、在一个或多个实施方案中，所述pdlbd14基因的编号为potri.013g156200。

70、在一个或多个实施方案中，ear基序包含lxlxl，x是任意氨基酸。优选地，ear基序包含(ldldlelrlgfa)n，n是1-10的整数，优选n是4。在一个或多个实施方案中，ear基序如seq id no:4所示。

71、在一个或多个实施方案中，所述pdcb5是杨柳科植物、杨属植物、杨树的pdcb5蛋白(pdpdcb5蛋白)。

72、本发明还提供一种调控植物植株性状、植物木质素合成、植物细胞壁厚度(木质部导管细胞壁和/或纤维细胞壁)、植物中pdcb5的表达、植物中胼胝质的沉积、植物胞间连丝通透性、和/或植物中细胞间物质运输的方法，所述方法包括：调控体系中lbd14的表达或活性。

73、在一个或多个实施方案中，所述调控为：

74、(1)上调lbd14的表达或活性，从而(i)使植株相比于野生型植株株高变矮、节间长度变短、茎干变细和茎干强度变低，(ii)抑制木质素合成，(iii)使木质部导管细胞壁变厚和/或纤维细胞壁变薄，(iv)上调pdcb5的表达，(v)促进植物中胼胝质在胞间连丝的沉积，(vi)抑制胞间连丝通透性，和/或(vii)阻碍细胞间物质运输；或

75、(2)下调lbd14的表达或活性，从而(i)使植株相比于野生型植株株高变高、节间长度变长、茎干变粗，(ii)使木质部导管细胞壁变薄和(iii)抑制植物中胼胝质在胞间连丝的沉积、(iv)促进胞间连丝通透性，和/或(v)促进细胞间物质运输。

76、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中lbd14蛋白表达或活性包括：将lbd14蛋白的编码序列转入植物，获得转化的植物。

77、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中lbd14蛋白表达或活性包括：

78、(a)特异性干扰lbd14基因转录和/或表达，

79、(b)下调lbd14蛋白活性，

80、(c)在植物中表达活性降低的lbd14蛋白，或

81、(d)在植物中表达与ear基序操作性连接的lbd14蛋白；优选地所述ear基序位于lbd14蛋白的n端或c端。

82、在一个或多个实施方案中，所述体系是细胞体系、组织体系或植物模型。

83、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(i)和项目(2)中(i)所述野生型植株节间长度平均为1.43cm，茎干直径平均为0.32cm，茎干强度为3.7n/cm2。

84、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(i)所述植株在节间长度上缩短了32％，茎干直径减少了7％-12％，茎干强度降低了66％-76％。

85、在一个或多个实施方案中，项目(2)中(i)所述植株在节间长度增加了35％-80％，茎干直接增加了9％-16％。

86、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(ii)所述木质素优选为s-木质素。

87、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(ii)所述编码木质素合成相关酶的基因包括ptr4cl3/5、ptrpal2/5和/或ptrcald5h。

88、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(iii)和项目(2)中(ii)所述细胞壁为细胞次生壁。

89、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(vi)和项目(2)中(iv)所述胞间连丝为射线薄壁细胞与纤维细胞之间胞间连丝。

90、在一个或多个实施方案中，项目(1)中(vii)和项目(2)中(v)所述细胞间物质运输为射线薄壁细胞和纤维细胞间的物质运输。

91、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨柳科植物。

92、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨属植物。

93、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨树。

94、在一个或多个实施方案中，lbd14能够直接结合到pdcb5的启动子，从而激活其表达。

95、在一个或多个实施方案中，lbd14基因是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14基因(pdlbd14基因)。

96、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

97、在一个或多个实施方案中，所述pdcb5是杨柳科植物、杨属植物、杨树的pdcb5蛋白(pdpdcb5蛋白)。

98、本发明还提供一种筛选调控植物植株性状、植物木质素合成、植物细胞壁厚度(木质部导管细胞壁和/或纤维细胞壁)、植物中pdcb5的表达、植物中胼胝质的沉积、植物胞间连丝通透性、和/或植物中细胞间物质运输的物质的方法，包括步骤：

99、(1)将候选物质与包含lbd14蛋白或其编码序列的体系接触，和

100、(2)检测体系中lbd14蛋白的表达或活性，并与对照中lbd14蛋白的表达或活性比较。

101、若lbd14蛋白的表达或活性小于对照，则所述候选物质(i)使植株相比于野生型植株株高变高、节间长度变长和茎干变粗，(ii)使木质部导管细胞壁变薄，(iii)抑制植物中胼胝质在胞间连丝的沉积、(iv)促进胞间连丝通透性，和/或(v)促进细胞间物质运输；

102、若lbd14蛋白的表达或活性大于对照，则所述候选物质(i)使植株相比于野生型植株株高变矮、节间长度变短、茎干变细和茎干强度变低，(ii)抑制木质素合成，(iii)使木质部导管细胞壁变厚和/或纤维细胞壁变薄，(iv)上调pdcb5的表达，(v)促进植物中胼胝质在胞间连丝的沉积，(vi)抑制胞间连丝通透性，和/或(vii)阻碍细胞间物质运输。

103、在一个或多个实施方案中，所述对照是不含所述物质的相同体系。

104、在一个或多个实施方案中，所述体系是溶液体系、细胞体系、组织体系或植物模型。

105、在一个或多个实施方案中，所述木质素优选为s-木质素。

106、在一个或多个实施方案中，所述编码木质素合成相关酶的基因包括ptr4cl3/5、ptrpal2/5和/或ptrcald5h。

107、在一个或多个实施方案中，所述细胞壁为细胞次生壁。

108、在一个或多个实施方案中，所述胞间连丝为射线薄壁细胞与纤维细胞之间胞间连丝。

109、在一个或多个实施方案中，所述细胞间物质运输为射线薄壁细胞和纤维细胞间的物质运输。

110、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨柳科植物。

111、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨属植物。

112、在一个或多个实施方案中，所述植物为杨树。

113、在一个或多个实施方案中，lbd14能够直接结合到pdcb5的启动子，从而激活其表达。

114、在一个或多个实施方案中，lbd14基因是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14基因(pdlbd14基因)。

115、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

116、在一个或多个实施方案中，所述pdcb5是杨柳科植物、杨属植物、杨树的pdcb5蛋白(pdpdcb5蛋白)。

117、本发明提供了获得转基因植物的方法，包括步骤：

118、(1)提供携带本文任一实施方案所述的核酸构建物的农杆菌，

119、(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

120、(3)选择转入了核酸序列的植物组织、器官或种子，所述核酸序列是：(a)编码lbd14蛋白的核酸序列，或(b)特异性干扰lbd14基因转录和/或表达的核酸序列；和

121、(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

122、在一个或多个实施方案中，lbd14基因是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14基因(pdlbd14基因)。

123、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。

124、本发明还提供一种pdlbd14启动子的用途，用于在射线薄壁细胞中表达感兴趣多肽。

125、在一个或多个实施方案中，所述射线薄壁细胞为次生木质部的射线薄壁细胞。

126、在一个或多个实施方案中，所述pdlbd14启动子序列如seq id no:1所示。

127、本发明还提供一种在植物中上调感兴趣基因的表达的方法，包括：在植物细胞中共表达感兴趣基因和lbd14，所述感兴趣基因与pdcb5启动子操作性连接。

128、在一个或多个实施方案中，lbd14蛋白是杨柳科植物、杨属植物、杨树的lbd14蛋白(pdlbd14蛋白)。在一个或多个实施方案中，所述pdlbd14蛋白的氨基酸序列如seq id no:3或与其具有至少80％相同性的序列所示。

129、在一个或多个实施方案中，所述lbd14蛋白的氨基酸序列与启动子操作性连接。所述启动子包括但不限于cas启动子、pdlbd14启动子。在一个或多个实施方案中，所述pdlbd14启动子序列如seq id no:1所示。

130、在一个或多个实施方案中，pdcb5的启动子的序列如seq id no:6所示。

131、本发明有益效果为：

132、发现了在杨树木质部射线薄壁细胞中特异表达的转录因子pdlbd14，利用该基因有望实现对射线薄壁细胞的特异性标记。发现pdlbd14能够通过直接结合到pdpdcb5的启动子区域，并激活其表达，阻碍了两者间的物质运输，影响纤维细胞细胞壁的形成。