一种基于细胞色素P450BM3的过加氧酶突变体V78I/F87G/T268D/A328F及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种基于细胞色素p450bm3的过加氧酶突变体v78i/f87g/t268d/a328f及其应用。

背景技术：

1、木质素占木质纤维素生物质干重的15%–30%，是地球上最丰富的可再生芳香族化合物来源。木质素及其解聚产物（如愈创木酚、紫丁香醇等芳香族单体）中丰富的甲氧基（–och3）导致氧含量高、反应活性不均，且在后续提质中引起过高的氢耗与催化剂积碳，严重制约了木质素基化学品与燃料的经济性。选择性地切除芳环上的甲氧基而保留苯环结构（即脱甲氧基），可将这些单体转化为苯酚、儿茶酚等高价值平台化合物，是木质素解聚产物提质升级的关键步骤。因此，系统开展木质素芳香族单体的脱甲氧基研究，对于发展木质素高值化转化技术具有重要的科学意义和实用价值。

2、传统化学o-脱甲基方法依赖三溴化硼（bbr3）等lewis酸试剂，需要无水、低温条件，并产生大量副产物，与水性生物炼制流程根本不兼容。自然界中，来自假单胞菌的细菌细胞色素p450 gcoa/gcob可区域选择性地将愈创木酚o-脱甲基为儿茶酚，但该酶严格依赖nad(p)h辅因子和多组分氧化还原伴侣蛋白，成本高、操作复杂，限制了无细胞应用。过氧化物旁路途径提供了一种无辅因子替代方案：h2o2可直接生成活性铁-氧中间体（compoundi），无需nad(p)h。天然过加氧酶型p450（如spα、oletje）通过将保守i-螺旋苏氨酸替换为羧酸残基来利用此途径。p450bm3（cyp102a1）来自巨大芽孢杆菌，是催化速率最快的自足型p450单加氧酶，可在大肠杆菌中高效表达，是理想的工程改造底盘。但其天然i-螺旋苏氨酸t268参与质子转移水网络，不利于h2o2高效利用。已有研究通过t268d/n替换、诱饵分子策略等将p450bm3转化为过加氧酶，但针对从愈创木酚到丁香醇全尺寸范围木质素单体的高效催化机制尚不明确，大体积丁香基底物的催化活性仍有待提高。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效p450bm3过加氧酶突变体，以h2o2为唯一氧化剂，无需nad(p)h辅因子，实现木质素芳香族单体的选择性o-脱甲基化，实现了对不同尺寸木质素单体高效的o-脱甲基化，为木质素单体绿色增值提供了高效经济的生物催化解决方案。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的目的之一在于提供一种基于细胞色素p450bm3的过加氧酶突变体，所述突变体以巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）来源的细胞色素p450bm3（cyp102a1）为骨架，以t268d为核心激活位点，并在f87、v78、a328、l75、a264位点进行组合突变；所述突变体包括：f87g/t268d、f87g/t268d/a328f、v78f/f87a/t268d/a328f、v78i/f87g/t268d/a328f、l75h/f87g/t268d/a328f、v78a/f87g/t268d/a328f、v78a/f87a/t268d/a328f或f87g/a264g/t268d/a328f；

4、所述f87g/t268d为在如seq  id  no .1所示氨基酸序列的基础上第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸；

5、所述f87g/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的基础上第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸；

6、所述v78f/f87a/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的基础上第78位缬氨酸突变为苯丙氨酸，第87位苯丙氨酸突变为丙氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸；

7、所述v78i/f87g/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的第78位缬氨酸突变为异亮氨酸，第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸；

8、所述l75h/f87g/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的第75位亮氨酸突变为组氨酸，第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸；

9、所述v78a/f87g/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的第78位缬氨酸突变为丙氨酸，第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸；

10、所述v78a/f87a/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的第78位缬氨酸突变为丙氨酸，第87位苯丙氨酸突变为丙氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸；

11、所述f87g/a264g/t268d/a328f为在如seq id no.1所示氨基酸序列的第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸，第264位丙氨酸突变为甘氨酸，第268位苏氨酸突变为天冬氨酸，第328位丙氨酸突变为苯丙氨酸。

12、本发明的目的之二在于提供一种表达载体，表达载体含有所述任意一项突变体。

13、本发明的目的之三在于提供一种基因工程菌，基因工程菌含有所述的表达载体。

14、本发明的目的之四在于提供所述突变体的应用，所述突变体以h2o2为氧化剂，催化愈创木酚、丁香醇或4-甲基丁香醇发生o-脱甲基化反应，生成相应的儿茶酚类产物，无需nad(p)h辅因子和电子传递蛋白。

15、进一步，催化愈创木酚时，最优突变体为v78f/f87a/t268d/a328f，总转化数（ton）高达1607；催化丁香醇时，最优突变体为v78f/f87a/t268d/a328f，ton为334；催化4-甲基丁香醇时，最优突变体为v78i/f87g/t268d/a328f，ton为1135。

16、进一步，所述的应用，在50 mm，ph 7.5磷酸钾缓冲液中，加入不同浓度底物和1 μmp450bm3突变体，孵育后加入h2o2启动反应，反应60 min后以1 m hcl终止。

17、进一步，催化愈创木酚时h2o2浓度为20 mm，最适温度25℃；催化丁香醇和4-甲基丁香醇时h2o2浓度为30 mm，催化丁香醇时最适温度为25℃，而催化4-甲基丁香醇时最适温度为30℃。

18、所述wt p450bm3（seq id no.1）的氨基酸序列为：

19、t i k e m p q p k t f g e l k n l p l l n t d k p v q a l m k i a d el g e i f k f e a p g r v t r y l s s q r l i k e a c d e s r f d k n l s q al k f v r d f a g d g l f t s w t h e k n w k k a h n i l l p s f s q q a m kg y h a m m v d i a v q l v q k w e r l n a d e h i e v p e d m t r l t l d ti g l c g f n y r f n s f y r d q p h p f i t s m v r a l d e a m n k l q r an p d d p a y d e n k r q f q e d i k v m n d l v d k i i a d r k a s g e q sd d l l t h m l n g k d p e t g e p l d d e n i r y q i i t f l i a g h e t ts g l l s f a l y f l v k n p h v l q k a a e e a a r v l v d p v p s y k q vk q l k y v g m v l n e a l r l w p t a p a f s l y a k e d t v l g g e y p le k g d e l m v l i p q l h r d k t i w g d d v e e f r p e r f e n p s a i pq h a f k p f g n g q r a c i g q q f a l h e a t l v l g m m l k h f d f e dh t n y e l d i k e t l t l k p e g f v v k a k s k k i p l 。

20、所述wt p450bm3（seq id no.2）的核苷酸序列为：

21、acaattaaagaaatgcctcagccaaaaacgtttggagagcttaaaaatttaccgttattaaacacagataaaccggttcaagctttgatgaaaattgcggatgaattaggagaaatctttaaattcgaggcgcctggtcgtgtaacgcgctacttatcaagtcagcgtctaattaaagaagcatgcgatgaatcacgctttgataaaaacttaagtcaagcgcttaaatttgtacgtgattttgcaggagacgggttatttacaagctggacgcatgaaaaaaattggaaaaaagcgcataatatcttacttccaagcttcagtcagcaggcaatgaaaggctatcatgcgatgatggtcgatatcgccgtgcagcttgttcaaaagtgggagcgtctaaatgcagatgagcatattgaagtaccggaagacatgacacgtttaacgcttgatacaattggtctttgcggctttaactatcgctttaacagcttttaccgagatcagcctcatccatttattacaagtatggtccgtgcactggatgaagcaatgaacaagctgcagcgagcaaatccagacgacccagcttatgatgaaaacaagcgccagtttcaagaagatatcaaggtgatgaacgacctagtagataaaattattgcagatcgcaaagcaagcggtgaacaaagcgatgatttattaacgcatatgctaaacggaaaagatccagaaacgggtgagccgcttgatgacgagaacattcgctatcaaattattacattcttaattgcgggacacgaaacaacaagtggtcttttatcatttgcgctgtatttcttagtgaaaaatccacatgtattacaaaaagcagcagaagaagcagcacgagttctagtagatcctgttccaagctacaaacaagtcaaacagcttaaatatgtcggcatggtcttaaacgaagcgctgcgcttatggccaactgctcctgcgttttccctatatgcaaaagaagatacggtgcttggaggagaatatcctttagaaaaaggcgacgaactaatggttctgattcctcagcttcaccgtgataaaacaatttggggagacgatgtggaagagttccgtccagagcgttttgaaaatccaagtgcgattccgcagcatgcgtttaaaccgtttggaaacggtcagcgtgcgtgtatcggtcagcagttcgctcttcatgaagcaacgctggtacttggtatgatgctaaaacactttgactttgaagatcatacaaactacgagctggatattaaagaaactttaacgttaaaacctgaaggctttgtggtaaaagcaaaatcgaaaaaaattccgcttggcggtattccttcacctagcactgaacagtctgctaaaaaagtacgcaaaaaggcagaaaac。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、（1）本发明突变体催化愈创木酚、丁香醇或4-甲基丁香醇发生o-脱甲基化反应，无需辅因子，整个催化体系仅需h2o2作为氧化剂，无需昂贵的nad(p)h及电子传递伴侣蛋白，大幅降低成本，简化操作流程；

24、（2）本发明突变体具有高活性与高选择性：最优突变体v78f/f87a/t268d/a328f对愈创木酚的ton高达1607，是单突变t268d的约67倍；v78i/f87g/t268d/a328f对4-甲基丁香醇的ton达1135，是单突变t268d的约45倍；

25、（3）本发明突变体的底物范围广：通过尺寸自适应策略，实现了从愈创木酚（小体积）到丁香醇（中体积）再到4-甲基丁香醇（大体积）全尺寸范围木质素单体的高效催化，揭示了体积依赖型工程规律：小体积底物依赖刚性芳香侧链的精确限域，大体积底物则依赖柔性疏水残基与空腔释放的协同适配；

26、（4）本发明突变体的催化反应条件温和，绿色可扩展：水相体系，常温操作，为木质素单体绿色增值提供了可扩展、环境友好的生物催化平台。