一种诊断结直肠癌的甲基化标志物组合及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种检测结直肠癌cfdna甲基化标志物组合及其应用。

背景技术：

1、结直肠癌（colorectal cancer, crc）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居高不下。根据美国癌症协会数据，2023年美国约有153,020人被新诊断为结直肠癌，52,550人死于该疾病。结直肠癌从癌前病变进展为癌历经数十年时间，早期筛查和诊断可有效降低其发病率和死亡率。

2、目前结直肠癌筛查的推荐方法包括结肠镜检查、粪便免疫化学检测（fit）、血清肿瘤标志物（如cea、ca19-9）等。结肠镜检查和活检是目前公认的诊断结直肠癌的金标准，但其属于侵入性有创检查，对设备和技术要求较高，患者依从性差，难以应用于大规模人群筛查。粪便免疫化学检测虽然无创，但其对早期癌和癌前病变的敏感性有限。传统血清肿瘤标志物cea、ca19-9等对结直肠癌的灵敏度低，对早期结直肠癌或癌前病变的诊断价值尤其差。

3、dna甲基化作为一种稳定的表观遗传修饰，已被认为是有潜力的癌症生物标志物。近年来，基于血浆游离dna（cfdna）甲基化的液体活检技术在肿瘤早筛领域展现出良好前景。目前已有部分基于血液甲基化的结直肠癌检测产品获批或处于研发阶段。例如，武汉艾米森开发的结直肠癌血浆甲基化检测产品（艾长健®）基于ntmt1和map3k14-as1双靶标，于2024年9月获得nmpa批准上市；其双靶标检测对结直肠癌的敏感性为84.8%（ⅰ期75.0%），进展期腺瘤敏感性为32.0%，特异性为91.5%。此外，septin9基因甲基化检测、sdc2基因甲基化检测等也已被报道用于结直肠癌筛查。

4、然而，由于血浆中cfdna丰度较低，基于血液cfdna甲基化的结直肠癌筛查比粪便检测更具挑战性。目前已有的血液甲基化检测产品在早期结直肠癌（尤其是ⅰ期）的检出率方面仍有较大提升空间，且针对癌前病变（如进展期腺瘤）的检测性能尚不理想。因此，开发敏感性更高、能够覆盖更早期病变的多标志物组合检测方法具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、本发明基于血液样本，利用三标志物甲基化组合（rbfox3、spock3和map3k14-as1）构建结直肠癌无创早筛检测模型，该模型不仅能提高患者依从性，而且具有良好的筛查性能。基于此，完成了本发明。

2、第一方面，本发明提供一种检测dna甲基化标志物组合的试剂在制备联合诊断结直肠癌的试剂中的应用，所述dna甲基化标志物组合包括位于rbfox3片段的chr17:77179709dna甲基化位点、位于spock3片段的chr4:168155124dna甲基化位点和位于map3k14-as1片段的chr2:47797133dna甲基化位点。

3、第二方面，本发明提供一种检测dna甲基化标志物组合的引物和探针组，所述dna甲基化标志物组合包括位于rbfox3片段的chr17:77179709dna甲基化位点、位于spock3片段的chr4:168155124dna甲基化位点和位于map3k14-as1片段的chr2:47797133dna甲基化位点；所述引物探针组包括靶向chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点以及chr2:47797133dna甲基化位点的正向引物、反向引物和探针；

4、靶向所述chr17:77179709dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示，探针序列如seq id no.3所示；

5、靶向所述chr4:168155124dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示，探针序列如seq id no.6所示；

6、靶向所述chr2:47797133dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示，探针序列如seq id no.9所示。

7、第三方面，本发明提供一种检测dna甲基化标志物组合的引物和探针组在制备联合诊断结直肠癌的试剂中的应用，所述dna甲基化标志物组合包括位于rbfox3片段的chr17:77179709dna甲基化位点、位于spock3片段的chr4:168155124dna甲基化位点和位于map3k14-as1片段的chr2:47797133dna甲基化位点；所述引物探针组包括靶向chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点以及chr2:47797133dna甲基化位点的正向引物、反向引物和探针；

8、靶向所述chr17:77179709dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示，探针序列如seq id no.3所示；

9、靶向所述chr4:168155124dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示，探针序列如seq id no.6所示；

10、靶向所述chr2:47797133dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示，探针序列如seq id no.9所示。

11、进一步，所述联合诊断结直肠癌通过计算联合诊断分数p(y=1|x)判断，所述p(y=1|x)计算公式如下：

12、 ，其中，分别为dna甲基化标志物组合中chr17:77179709dna、chr4:168155124dna和chr2:47797133dna甲基化位点的δct值或dct值，为截距，为各标志物的回归系数（权重）。

13、更进一步，所述δct通过如下公式计算：δct = ct_靶标-ct_内参；其中，靶标是指chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点或chr2:47797133dna甲基化位点；内参指基因actb。

14、进一步，所述dct通过如下公式计算：

15、dct = (ct_靶标-ct_内参) / (45-ct_内参)

16、其中，靶标是指chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点或chr2:47797133dna甲基化位点；内参指基因actb。

17、更进一步，所述ct_靶标通过多重荧光探针pcr技术检测获得。

18、进一步，所述内参基因正向引物序列如seq id no.10所示，反向引物序列如seqid no.11所示，探针序列如seq id no.12所示。

19、进一步，当联合诊断分数≥0.5判定受试者为结直肠癌阳性；当联合诊断分数<0.5判定受试者为结直肠癌阴性。

20、第四方面，本发明提供一种联合诊断结直肠癌的模型，所述模型包括数据输入模块、数据处理模块以及数据输出模块；其中，

21、数据输入模块输入受试者生物样本中dna甲基化标志物组合的δct值或dct值；所述dna甲基化标志物组合包括位于rbfox3片段的chr17:77179709dna甲基化位点、位于spock3片段的chr4:168155124dna甲基化位点和位于map3k14-as1片段的chr2:47797133dna甲基化位点；

22、数据处理模块是采用逻辑回归（logistic regression）模型，通过公式计算联合诊断分数；其中，分别为dna甲基化标志物组合中chr17:77179709dna、chr4:168155124dna和chr2:47797133dna甲基化位点的ct值、δct值或dct值，为截距，为各标志物的回归系数（权重）；

23、数据输出模块是输出联合诊断分数，通过该分值诊断结直肠癌患者。

24、进一步，所述数据输入模块中，生物样本包括血清、血浆或全血。

25、优选的，所述生物样本为血浆。

26、进一步，所述数据输入模块中，受试者生物样本中dna甲基化标志物组合的ct值通过多重荧光探针pcr技术检测获得。

27、更进一步，所述多重荧光探针pcr技术检测的引物和探针组包括靶向chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点、chr2:47797133dna甲基化位点以及内参基因的正向引物、反向引物和探针：

28、靶向所述chr17:77179709dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示，探针序列如seq id no.3所示；

29、靶向所述chr4:168155124dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示，探针序列如seq id no.6所示；

30、靶向所述chr2:47797133dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示，探针序列如seq id no.9所示。

31、进一步，所述数据输入模块中，δct通过如下公式计算：δct = ct_靶标-ct_内参；其中，靶标是指chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点或chr2:47797133dna甲基化位点；内参指基因actb。

32、进一步，所述数据输入模块中，dct通过如下公式计算：

33、dct = (ct_靶标-ct_内参) / (45-ct_内参)

34、其中，靶标是指chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点或chr2:47797133dna甲基化位点；内参指基因actb。

35、进一步，所述内参基因正向引物序列如seq id no.10所示，反向引物序列如seqid no.11所示，探针序列如seq id no.12所示。

36、进一步，所述数据输出模块中，当联合诊断分数≥0.5判定受试者为结直肠癌阳性；当联合诊断分数<0.5判定受试者为结直肠癌阴性。

37、第五方面，本发明提供一种联合诊断结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒含有检测dna甲基化标志物组合的引物和探针组；所述dna甲基化标志物包括chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点和chr2:47797133dna甲基化位点；所述引物和探针组包括靶向chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点、chr2:47797133dna甲基化位点以及内参基因的正向引物、反向引物和探针；

38、靶向所述chr17:77179709dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示，探针序列如seq id no.3所示；

39、靶向所述chr4:168155124dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示，探针序列如seq id no.6所示；

40、靶向所述chr2:47797133dna甲基化位点的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示，探针序列如seq id no.9所示。

41、进一步，所述联合诊断结直肠癌通过计算联合诊断分数p(y=1|x)判断，所述p(y=1|x)计算公式如下：

42、 ，其中，分别为chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点、chr2:47797133dna甲基化位点的δct 或dct值，为截距，为各标志物的回归系数（权重）。

43、更进一步，所述δct通过如下公式计算：δct = ct_靶标-ct_内参；其中，靶标是指chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点或chr2:47797133dna甲基化位点；内参指基因actb。

44、进一步，所述dct通过如下公式计算：

45、dct = (ct_靶标-ct_内参) / (45-ct_内参)

46、其中，靶标是指chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点或chr2:47797133dna甲基化位点；内参指基因actb。

47、进一步，所述内参基因正向引物序列如seq id no.10所示，反向引物序列如seqid no.11所示，探针序列如seq id no.12所示。

48、进一步，当联合诊断分数≥0.5判定受试者为结直肠癌阳性；当联合诊断分数<0.5判定受试者为结直肠癌阴性。

49、有益效果

50、本发明基于血液样本（血浆cfdna），利用dna甲基化标志物组合（chr17:77179709dna甲基化位点、chr4:168155124dna甲基化位点和chr2:47797133dna甲基化位点）构建结直肠癌无创早筛检测模型。该模型有效解决了传统筛查手段依从性低、侵入性强的问题，同时具备优异的筛查效能与临床应用价值，具体优势如下：

51、1、无创便捷，适用更多人群

52、本发明检测方法仅需采集外周血样本，无需结肠镜等侵入性操作，检测方式温和，患者依从性好，适用于大规模人群筛查工作。

53、2、诊断效能优秀，筛查准确

54、在基于测序数据的独立验证队列中，本发明3标志物组合的auc为0.84（95% ci:0.74-0.93），灵敏度和特异度分别为80%和81%。

55、3、早期筛查能力突出，针对性强

56、在基于多重荧光pcr的临床验证队列表面，本发明3标志物组合对ⅱ期结直肠癌筛查的灵敏度高达92.3%，对具有临床意义的进展期肿瘤具有卓越的检出能力。

57、4、多维度协同诊断

58、本发明三个标志物分别涉及rna剪接调控、细胞外基质重塑和非经典nf-κb信号通路，可从不同病理生理层面捕捉结直肠癌信号，多机制互补协同，有效提升模型筛查的稳健性与可靠性。

59、5、适用于临床转化

60、本发明基于3标志物组合建立的多重荧光pcr检测体系，操作流程简便、检测成本可控、设备门槛低，适配临床常规检测场景，可快速落地应用于大规模人群的结直肠癌早期筛查，临床转化价值极高。