过表达SLC25A19的嵌合抗原受体T细胞的构建方法及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞的构建方法及其应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞免疫治疗通过对t细胞进行遗传修饰，使其表达能够特异性识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体，从而赋予t细胞靶向识别和杀伤肿瘤细胞的能力。car-t细胞疗法已在部分血液系统恶性肿瘤的治疗中取得较好的临床效果，但其在实体瘤中的治疗效果仍受到限制。

2、实体瘤具有复杂的肿瘤微环境，通常伴随肿瘤抗原异质性、免疫细胞浸润不足、免疫抑制性细胞和细胞因子积聚、低氧、营养物质缺乏以及免疫抑制性代谢产物增加等特征。上述因素可影响car-t细胞的肿瘤浸润、存活、增殖和效应功能，并可促使car-t细胞出现代谢功能受损、持续性降低及耗竭表型，从而限制其对实体瘤的治疗效果。

3、为提高car-t细胞在实体瘤中的抗肿瘤活性，现有技术已提出多种改造策略。例如，通过选择cd28或4-1bb等不同共刺激结构域调节car-t细胞的活化强度、代谢特征和持久性；通过敲除或抑制pd-1等免疫抑制性分子减轻抑制性信号；通过使car-t细胞表达或分泌细胞因子、趋化因子及其他免疫调节分子改善其肿瘤浸润和效应功能；以及通过调节葡萄糖代谢、线粒体代谢和氧化还原状态等方式增强car-t细胞的代谢适应能力。已有研究表明，过表达葡萄糖转运蛋白glut1可在部分模型中改善car-t细胞的代谢状态、记忆表型和抗肿瘤活性。

4、然而，上述改造策略仍存在一定局限性。例如，共刺激结构域的选择难以完全克服实体瘤微环境中的营养竞争和持续代谢应激；单纯阻断免疫检查点主要作用于抑制性受体信号，未必能够直接恢复car-t细胞受损的线粒体代谢；细胞因子分泌型car-t细胞还需要兼顾细胞因子释放水平及相关安全性；现有代谢改造策略通常仅针对某一类营养物质或特定代谢通路，其在不同肿瘤微环境中的适用性仍需进一步提高。

5、slc25a19是一种定位于线粒体内膜的硫胺素焦磷酸转运蛋白，能够将硫胺素焦磷酸运输至线粒体基质。硫胺素焦磷酸是多种线粒体代谢酶发挥催化功能所必需的辅酶，因此，slc25a19可能参与维持细胞线粒体能量代谢和代谢稳态。

6、但是，现有技术对于slc25a19在car-t细胞代谢调控、耗竭表型和抗肿瘤功能中的作用尚缺乏充分研究。因此，仍有必要提供一种基于slc25a19修饰的car-t细胞及其构建方法，以改善car-t细胞的代谢状态、肿瘤微环境适应能力和实体瘤抗肿瘤功能。

技术实现思路

1、为解决现有car-t细胞在实体瘤微环境中代谢适应能力不足、功能持续性较差以及容易出现功能衰减等问题，本发明提供一种过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞、其构建方法及应用。

2、本发明通过在嵌合抗原受体t细胞中引入slc25a19表达单元，改善car-t细胞的代谢状态和功能维持能力，从而增强car-t细胞在营养物质缺乏等不利肿瘤微环境中的适应能力及抗肿瘤活性。

3、发明人通过流式细胞术检测肿瘤患者外周血cd8+t细胞中slc25a19的表达情况，并分析其与t细胞功能表型之间的关系。结果显示，与slc25a19低表达的cd8+t细胞相比，slc25a19高表达的cd8+t细胞表现出较强的效应功能，提示slc25a19的表达与cd8+t细胞的功能状态相关，结果如图1所示。

4、基于上述发现，本发明采用遗传修饰方法使car-t细胞过表达slc25a19，获得slc25a19修饰的car-t细胞。与未过表达slc25a19的相应car-t细胞相比，所述slc25a19修饰的car-t细胞具有改善的代谢状态、较低的耗竭相关分子表达以及增强的抗肿瘤功能。

5、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案。

6、第一方面，本发明提供一种过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞，所述t细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体，并表达外源性slc25a19。

7、在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括依次连接的信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号结构域。

8、优选地，所述嵌合抗原受体靶向cd276，所述过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞为slc25a19-cd276-car-t细胞。

9、第二方面，本发明提供一种所述过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞的构建方法，包括以下步骤：

10、1. 构建编码嵌合抗原受体和slc25a19的共表达载体；

11、2. 利用所述共表达载体制备重组慢病毒；

12、3. 采用所述重组慢病毒转导经激活的t细胞；

13、4. 对转导后的t细胞进行培养和扩增，获得过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞。

14、作为一种优选的技术方案，本发明所述过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞的构建方法，包括以下步骤：

15、（一）载体构建：

16、（1）根据人cd276抗原设计靶向cd276的单链可变片段（single-chain variablefragment，scfv）编码序列，并依次连接信号肽、cd276特异性scfv、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb共刺激结构域及cd3ζ胞内信号结构域的编码序列，构建完整的cd276靶向嵌合抗原受体编码序列，即cd276-car编码序列；

17、（2）人工合成人源slc25a19的编码序列；

18、（3）将cd276-car编码序列与slc25a19编码序列通过t2a肽编码序列连接，使二者位于同一开放阅读框内，并将所得共表达序列克隆至慢病毒转移载体pcdh-ef1α中，获得重组慢病毒表达载体pcdh-ef1α-cd276-car-t2a-slc25a19；所述t2a肽可通过核糖体跳跃机制促进cd276-car和slc25a19分别表达，从而实现两种目的蛋白的共表达；

19、（4）将步骤（3）获得的重组慢病毒表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，根据所使用载体携带的抗性筛选标记进行抗生素筛选；挑取单克隆菌落进行菌液pcr和测序鉴定，筛选序列及连接方向正确的阳性克隆；对鉴定正确的菌株进行扩大培养，并采用无内毒素质粒提取试剂提取重组慢病毒表达载体，测定质粒浓度和纯度后保存备用；

20、（二）慢病毒包装：

21、（5）病毒包装及病毒浓缩液的制备：

22、将opti-mem无血清培养基与转染试剂混合，制得混合液ⅰ，于室温孵育5～10 min；将opti-mem无血清培养基与慢病毒包装质粒、包膜质粒及步骤（3）制备的重组慢病毒表达载体混合，制得混合液ⅱ，于室温孵育5～10 min；将混合液ⅰ和混合液ⅱ按照1∶1的体积比混合，于室温孵育10～20 min，形成质粒-转染试剂复合物；

23、将所述质粒-转染试剂复合物均匀滴加至预先接种有hek293t细胞的培养容器中；转染时hek293t细胞融合度为70%～90%；将细胞置于37℃、5% co2条件下培养6～10 h后，更换新鲜培养基，并继续培养24～72 h，收集含有重组慢病毒的细胞培养上清液；

24、将所述细胞培养上清液进行低速离心，以除去细胞及较大的细胞碎片，随后经0.45 μm滤膜过滤，获得澄清的病毒上清液；将所述病毒上清液转移至超速离心管中，于4℃条件下超速离心1～5 h；离心结束后弃去上清液，采用适量无血清培养基重悬病毒沉淀，获得重组慢病毒浓缩液；

25、（6）病毒滴度测定：

26、以1×105个细胞/孔的密度将hek293t细胞接种于24孔培养板中，培养至细胞融合度达到约50%～70%后进行病毒感染；

27、根据浓缩前慢病毒滴度约为5×106tu/ml以及步骤（5）中病毒体积浓缩倍数，对病毒浓缩液的滴度进行初步估算；制备moi 100病毒工作液；

28、将所述moi 100病毒工作液采用完全培养基进行5倍连续梯度稀释，依次获得理论moi约为100、20、4、0.8和0.16的病毒工作液；分别取100 μl各梯度病毒工作液加入对应的hek293t细胞培养孔中，并设置不加病毒的阴性对照孔；每孔补加培养基至相同总体积；

29、细胞于37 ℃、5% co2条件下培养14～20 h后，更换为新鲜完全培养基，并继续培养24～72 h；随后收集细胞，采用流式细胞术检测目的基因或嵌合抗原受体的阳性表达率；

30、选择目的基因阳性率为1%～30%的感染孔计算慢病毒功能滴度；

31、（7）细胞感染和细胞扩增：

32、将经适当稀释的抗凝人外周血缓慢铺加于人外周血淋巴细胞分离液上层，经密度梯度离心20～30 min后，吸取外周血单个核细胞所在的白膜层；洗涤细胞后，采用磁珠分选法获得cd3+t细胞；

33、向分选获得的cd3+t细胞中加入cd3/cd28活化磁珠进行刺激；将cd3+t细胞激活24～48 h后进行慢病毒转导；

34、根据步骤（6）测得的慢病毒功能滴度，按照moi为1～20将步骤（5）制备的慢病毒浓缩液加入活化后的cd3+t细胞中；病毒感染体系中加入转导增强剂，并通过离心感染1～3 h促进慢病毒转导；离心结束后，将细胞置于37℃、5% co2条件下继续培养，随后更换新鲜t细胞培养基。

35、转导后的细胞继续培养24～48 h，获得cd276靶向car-t细胞或过表达slc25a19的cd276靶向car-t细胞；收集部分细胞检测car阳性率，其余细胞在含细胞因子的t细胞培养基中继续扩增。

36、具体地，步骤（1）中，所述靶向cd276的单链可变片段scfv的编码序列如seq idno.2所示。

37、具体地，步骤（2）中，所述slc25a19的编码序列如seq id no.1所示。

38、具体地，步骤（3）中，所述t2a肽的编码序列为：

39、gagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct。

40、具体地，步骤（3）中，所述慢病毒表达载体为pcdh-ef1α载体。

41、具体地，步骤（5）中，所述转染试剂为聚乙烯亚胺，英文名称为polyethylenimine，简称pei。

42、具体地，步骤（5）中，所述辅助质粒包括慢病毒包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g，pspax2、pmd2.g与重组慢病毒表达载体的质量比为3：2：5。

43、具体地，步骤（5）中，所述病毒浓缩倍数按照浓缩前病毒上清液总体积与病毒沉淀最终重悬体积之比计算，所获得的重组慢病毒浓缩液的体积浓缩倍数为50～300倍。

44、具体地，步骤（6）中，moi为3～10；更优选地，moi为10。

45、具体地，步骤（6）中，在制备moi 100病毒工作液时，当病毒体积浓缩倍数分别为50倍、100倍和300倍时，病毒浓缩液的估算滴度分别约为2.5×108tu/ml、5×108tu/ml和1.5×109tu/ml；

46、以每孔1×105个hek293t细胞、初始感染复数为moi 100进行计算；当病毒体积浓缩倍数为50倍、100倍和300倍时，每孔分别取40 μl、20 μl和约6.7 μl病毒浓缩液，并采用完全培养基补足至100 μl，制得对应的moi 100病毒工作液。

47、具体地，步骤（6）中，慢病毒功能滴度按照下式计算：

48、病毒滴度（tu/ml）＝感染时细胞数×阳性细胞比例×病毒稀释倍数÷每孔加入的病毒液体积；

49、其中，阳性细胞比例以小数表示，病毒液体积以ml表示；采用至少两个阳性率处于有效范围内的稀释孔分别计算病毒滴度，并取其平均值作为该批慢病毒的功能滴度；剩余慢病毒浓缩液用于后续t细胞转导。

50、具体地，步骤（7）中，所述cd3/cd28活化磁珠为miltenyi产品，货号为130-111-160。

51、具体地，步骤（7）中，所述car-t细胞包括cd276-car-t细胞和slc25a19-cd276-car-t细胞中的一种或两种。

52、具体地，步骤（7）中，采用fitc标记的protein l对细胞进行染色，以未转导的cd3+t细胞作为阴性对照，通过流式细胞术检测car的表达情况。

53、基于同一发明构思，本发明还提供一种采用上述方法制备得到的过表达slc25a19的cd276靶向嵌合抗原受体t细胞，即slc25a19-cd276-car-t细胞。

54、第三方面，本发明提供上述过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞在制备用于预防、抑制或治疗肿瘤产品中的应用。

55、进一步地，本发明还提供上述过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞在制备用于预防、抑制或治疗食管鳞状细胞癌产品中的应用。

56、具体地，所述肿瘤为肝癌、肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、食管鳞状细胞癌等。

57、具体地，所述产品为药物、试剂、试剂盒、药剂或生物芯片等。

58、进一步地，所述过表达slc25a19的cd276靶向嵌合抗原受体t细胞能够抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖，或者抑制食管鳞状细胞癌人源移植瘤的生长。

59、第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述过表达slc25a19的嵌合抗原受体t细胞以及药学上可接受的载体或辅料。

60、与现有技术相比，本发明的优势在于：

61、本发明揭示了slc25a19在嵌合抗原受体t细胞功能调控中的作用，并提供了一种通过遗传修饰使car-t细胞过表达slc25a19的技术方案。通过在car-t细胞中引入slc25a19，可改善car-t细胞的线粒体功能和代谢状态，增强其在营养物质缺乏等不利肿瘤微环境中的存活能力和功能维持能力。与未过表达slc25a19的car-t细胞相比，本发明制备的car-t细胞表现出较低的耗竭标志物表达、较强的效应功能以及增强的抗肿瘤活性。

62、本发明通过将slc25a19介导的代谢调控与靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体相结合，提高了car-t细胞对肿瘤微环境的适应能力，为改善car-t细胞在实体瘤治疗中的持续性和抗肿瘤效果提供了新的技术方案。