新型信号转换受体的制作方法

本发明涉及生物，具体地涉及一种新型信号转换受体。

背景技术：

1、转换受体是一类能够将免疫抑制信号转换为免疫激活信号的人工改造的基因工程受体。在免疫抑制性的肿瘤微环境中，免疫细胞如t细胞表面的免疫检查点受体如pd-1、ctla-4、lag-3和tigit等会被诱导上升表达，肿瘤细胞表面表达的相应配体通过结合上述受体抑制t细胞的激活。为刺激免疫效应细胞的增殖和提升其肿瘤免疫的效果，需要降低pd-1、ctla-4、lag-3和tigit对肿瘤生长的促进作用以及对免疫微环境的抑制。现在仍然需要更多的包括针对免疫检查点受体的信号转换受体分子在内的手段对免疫效应细胞进行改造和激活。

技术实现思路

1、本发明构建了一种新的基于cd25胞外间隔区和cd25跨膜区的信号转换受体。表达该信号转换受体的免疫效应细胞如til较之对照细胞具有更高的阳性率、激活水平和靶细胞杀伤能力。

2、本发明提供一种信号转换受体，包含：胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞外区包含配体结合区和胞外间隔区；所述跨膜区包含cd25跨膜区结构域或其保留了跨膜信号传导功能的功能片段或突变体。

3、在一个或多个实施方案中，所述配体结合区包含免疫检查点受体胞外结构域或其保留了配体结合功能的功能片段或突变体。

4、在一个或多个实施方案中，所述胞外间隔区包含cd25胞外间隔区或其保留了胞外信号传导功能的功能片段或突变体。

5、在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点受体胞外结构域选自pd-1胞外结构域、ctla-4胞外结构域、lag-3胞外结构域和tigit胞外结构域中的任一种。

6、在一个或多个实施方案中，所述配体结合区包含pd-1胞外结构域或其保留了配体结合功能的功能片段或突变体，或ctla-4胞外结构域或其保留了配体结合功能的功能片段或突变体，或lag-3胞外结构域或其保留了配体结合功能的功能片段或突变体，或tigit胞外结构域或其保留了配体结合功能的功能片段或突变体。

7、在一个或多个实施方案中，所述pd-1胞外结构域包含seq id no:44所示的氨基酸序列或与seq id no:44具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

8、在一个或多个实施方案中，所述ctla-4胞外结构域包含seq id no:45所示的氨基酸序列或与seq id no:45具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

9、在一个或多个实施方案中，所述lag-3胞外结构域包含：seq id no:46所示的氨基酸序列或与seq id no:46具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

10、在一个或多个实施方案中，所述tigit胞外结构域包含：seq id no:47所示的氨基酸序列或与seq id no:47具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

11、在一个或多个实施方案中，所述cd25胞外间隔区结构域位于所述胞外区的n端或c端。

12、在一个或多个实施方案中，所述cd25胞外间隔区的氨基酸序列如seq id no:49所示或与seq id no:49具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

13、在一个或多个实施方案中，所述胞外间隔区还包含cd28胞外间隔区。

14、在一个或多个实施方案中，所述cd28胞外间隔区结构域位于所述胞外区的n端或c端。

15、在一个或多个实施方案中，所述cd28胞外间隔区的氨基酸序列如seq id no:48所示或与seq id no:48具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

16、在一些实施方案中，所述胞外间隔区结构域与相邻结构域之间还具有接头。

17、在一个或多个实施方案中，所述cd25跨膜区结构域的氨基酸序列如seq id no:51所示或与seq id no:51具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

18、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的胞外区还包含信号肽，例如cd8信号肽、cd4信号肽、cd25信号肽、cd28信号肽、cd137信号肽、egfr信号肽、tgf-βr1信号肽、tgf-βr2信号肽、tgf-βr3信号肽和轻链信号肽。

19、在一个或多个实施方案中，cd8信号肽的氨基酸序列如seq id no:43所示。

20、在一个或多个实施方案中，所述胞内区包含共刺激信号分子的胞内结构域或其保留了共刺激信号分子传递共刺激信号的生物学功能的功能片段或突变体。

21、在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子包括cd28、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、lck、icos、dap10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、il-2r、il-4r、il-7r、il-10r、il-12r、il-15r、il-21r、cd27和cd40中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子选自cd25、cd28、ox40。

22、在一个或多个实施方案中，所述胞内区包含cd25胞内结构域、cd28胞内结构域和ox40胞内结构域中的一个或多个。

23、在一个或多个实施方案中，所述cd25胞内结构域的氨基酸序列如seq id no:53所示或与seq id no:53具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

24、在一个或多个实施方案中，cd28胞内结构域的氨基酸序列如seq id no:52所示或与seq id no:52具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

25、在一个或多个实施方案中，ox40胞内结构域的氨基酸序列如seq id no:56所示或与seq id no:56具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。在一个或多个实施方案中，所述胞内区还包含cd62l胞内结构域或其截短片段。

26、在一个或多个实施方案中，所述cd62l胞内结构域的氨基酸序列如seq id no:54所示或与seq id no:54具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

27、在一个或多个实施方案中，所述cd62l胞内结构域为截短的cd62l胞内结构域。

28、在一个或多个实施方案中，所述截短的cd62l胞内结构域的氨基酸序列如seq idno:55所示或与seq id no:55具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

29、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的胞外区包含（i）pd-1胞外结构域，和（ii）cd25胞外间隔区、或cd25胞外间隔区和cd28胞外间隔区；所述跨膜区包含cd25跨膜区；所述共刺激信号分子的胞内结构域为（1）cd28胞内结构域和ox40胞内结构域，（2）cd25胞内结构域和ox40胞内结构域，（3）cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域或（4）截短的cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域。

30、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的胞外区包含（i）ctla-4胞外结构域，和（ii）cd25胞外间隔区、或cd25胞外间隔区和cd28胞外间隔区；所述跨膜区包含cd25跨膜区；所述共刺激信号分子的胞内结构域为（1）cd28胞内结构域和ox40胞内结构域，（2）cd25胞内结构域和ox40胞内结构域，（3）cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域或（4）截短的cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域。

31、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的胞外区包含（i）lag-3胞外结构域，和（ii）cd25胞外间隔区、或cd25胞外间隔区和cd28胞外间隔区；所述跨膜区包含cd25跨膜区；所述共刺激信号分子的胞内结构域为（1）cd28胞内结构域和ox40胞内结构域，（2）cd25胞内结构域和ox40胞内结构域，（3）cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域或（4）截短的cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域。

32、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的胞外区包含（i）tigit胞外结构域，和（ii）cd25胞外间隔区、或cd25胞外间隔区和cd28胞外间隔区；所述跨膜区包含cd25跨膜区；所述共刺激信号分子的胞内结构域为（1）cd28胞内结构域和ox40胞内结构域，（2）cd25胞内结构域和ox40胞内结构域，（3）cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域或（4）截短的cd62l胞内结构域和ox40胞内结构域。

33、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的氨基酸序列如seq id no:57-84中任一项所示。

34、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体的氨基酸序列如seq id no:58、59、63、65、66、70、72、73、77、79、80和84中任一项。

35、本发明还提供一种多核苷酸分子，选自：编码本发明任一实施方案所述的信号转换受体的多核苷酸分子或其互补序列。

36、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，胞外区是pd-1胞外结构域，其编码序列如seq id no:2所示。

37、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，胞外区是ctla-4胞外结构域，其编码序列如seq id no:3所示。

38、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，胞外区是lag-3胞外结构域，其编码序列如seq id no:4所示。

39、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，胞外区是tigit胞外结构域，其编码序列如seq id no:5所示。

40、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，胞外间隔区为cd25胞外间隔区，其编码序列如seq id no:7所示。在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，跨膜区为cd25跨膜区，其编码序列如seq id no:9所示。

41、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，共刺激信号分子的胞内结构域包含cd28胞内结构域，其编码序列如seq id no:10所示。

42、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，共刺激信号分子的胞内结构域包含cd25胞内结构域，其编码序列如seq id no:11所示。

43、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，共刺信号激分子的胞内结构域包含cd62l胞内结构域，其编码序列如seq id no:12所示。

44、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体中，共刺激信号分子的胞内结构域包含截短的cd62l胞内结构域，其编码序列如seq id no:13所示。

45、在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域包含ox40胞内结构域，其编码序列如seq id no:14所示。

46、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸分子的序列如seq id no: 15-42中任一项所示，或者为任一所示多核苷酸分子的互补序列。

47、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸分子的序列如seq id no: 16、17、21、23、24、28、30、31、35、37、38和42中任一项所示，或者为任一所示多核苷酸分子的互补序列。

48、本发明还提供一种核酸构建体，含有本发明任一实施方案所述的多核苷酸分子。

49、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为载体；包括病毒载体或非病毒载体，优选为非病毒载体。

50、在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体或整合载体。

51、本发明还提供一种基因工程化的细胞，其

52、（1）包含、表达或分泌本发明任一实施方案所述的信号转换受体，和/或

53、（2）携带所述信号转换受体的编码序列，优选包含本发明任一实施方案所述的多核苷酸分子，和/或

54、（3）包含本发明任一实施方案所述的核酸构建物。

55、在一个或多个实施方案中，所述细胞为免疫细胞。

56、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞包括t细胞、nk细胞、car-t、car-nk、tcr-t、cik、nkt和til。

57、在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达car，或携带car的编码序列。

58、在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达外源tcr，或携带外源tcr的编码序列。

59、本发明还提供药物组合物，包含药学上可接受的辅料或选自本发明任一实施方案所述的信号转换受体、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞中的一种或多种。所述药物组合物用于治疗或预防肿瘤。

60、在一个或多个实施方案中，所述肿瘤包括呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、神经系统肿瘤、生殖系统肿瘤、皮肤肿瘤；优选包括选自以下的一种或多种：肝癌、胃肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫肉瘤、外阴癌、乳腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、输卵管癌、喉癌、甲状腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌和脑癌。

61、本发明还提供选自本发明任一实施方案所述的信号转换受体、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞中的一种或多种在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。

62、在一个或多个实施方案中，所述肿瘤包括呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、神经系统肿瘤、生殖系统肿瘤、皮肤肿瘤；优选包括选自以下的一种或多种：肝癌、胃肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫肉瘤、外阴癌、乳腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、输卵管癌、喉癌、甲状腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌和脑癌。