一种染料木素生产工艺的制作方法

本技术涉及植物提取，具体涉及一种染料木素生产工艺。

背景技术：

1、染料木素是一种天然异黄酮类化合物。其具有植物雌激素活性，能够与雌激素受体结合，同时具有抗氧化性、抑制酪氨酸蛋白激酶活性、诱导肿瘤细胞程序性死亡与抑制血管生成等多种药理作用，在骨质疏松防治、肿瘤辅助治疗以及心血管保护等领域具有广阔应用前景。

2、槐角为豆科植物槐的干燥成熟果实。槐角中的槐角苷含量达到9%以上，槐角苷经水解脱去糖基后即可转化为活性苷元染料木素，是制备染料木素的理想原料。此外槐角中还含有染料木苷、槐角双苷等多种以染料木素为苷元的糖苷类成分，经水解后也可转化为染料木素。

3、目前，从槐角中制备染料木素的工艺包括酸水解法、酶降解辅助提取法和生物转化法，但现有技术均存在不同的缺陷，制约了工业化的应用。

4、传统酸水解法是将槐角用乙醇提取后，加入盐酸或硫酸进行回流水解，再经氯仿、丙酮或乙酸乙酯等有机溶剂萃取纯化。中国专利cn1465571a和cn1465570a均采用了酸水解结合有机溶剂萃取的工艺路线。该类工艺存在以下突出问题：（1）酸水解过程需使用强酸并在加热条件下进行，对反应设备耐腐蚀要求较高，增加了设备投资与维护成本，同时存在操作安全隐患；（2）强酸长时间加热，容易导致染料木素苷元的结构破坏或发生聚合，影响产品提取率和品质；（3）后续纯化需使用氯仿、二氯甲烷等有毒试剂进行多次萃取，不仅增加了试剂回收成本，还可能导致有机试剂残留超标；（4）分离过程有大量酸性废液与有机废液产生，增加了生产成本。

5、专利cn101760488a采用先酶解后提取的策略，使用纤维素酶、β-葡聚糖苷酶等商品酶对槐角粉末进行预处理，破坏细胞壁结构，再用乙醇回流提取。该工艺一定程度上避免了强酸的使用，但仍存在以下不足：（1）该工艺所使用的纤维素酶、β-葡聚糖苷酶属于破壁酶，其作用对象是植物细胞壁中的纤维素和半纤维素，目的是破坏细胞壁结构，帮助槐角苷等物质溶解，而非直接水解槐角苷的糖苷键，若想获得活性染料木素，仍需额外的酸水解或酶解转化步骤；（2）该工艺重结晶仅依靠乙醇回流调节ph结晶，步骤单一，提取液中除目标物外还含有多种与染料木素结构类似的化合物，导致产品纯度低；（3）槐角中除槐角苷外，还含有染料木苷、槐角双苷等多种以染料木素为苷元的糖苷类化合物，纤维素酶等破壁酶，无法直接作用于这些化合物，导致原料利用率不高。

6、文章（陈翔,王萍萍,吴霞,等.原位生物转化法提高槐角中染料木素的含量[j].中国现代应用药学,2020,37(18):2201-2205）报道了一种利用米根霉的发酵粗液对槐角粉末进行原位生物转化的工艺，可将槐角中染料木素含量提升约14倍，但存在以下问题：（1）该工艺使用米根霉发酵后的粗酶液，其中除目标糖苷酶外，还含有多种酶与微生物代谢产物，成分复杂，使反应过程难以精准调控，产业化门槛高；（2）该工艺转化时间长达32h，单位时间产出率较传统工艺低下；（3）该工艺需先将米根霉培养发酵，增加了操作步骤。

7、因此，本领域需要开发一种酶解作用直接、条件温和可控且易于工业化放大的工艺。

技术实现思路

1、为解决现有染料木素生产中，废水废酸过多、有机试剂毒性大和原料利用率低等问题。本技术提供了一种染料木素生产工艺，该工艺先将槐角粉碎后用热水提取并浓缩，再向浓缩液中加入mofs封装的柚苷酶进行定向酶解，之后启动磁场，过滤收集滤饼，再向滤饼中加入溶剂浸泡，加入活性炭脱色，最后过滤、加热浓缩、冷却重结晶得到染料木素。该工艺具有反应条件温和、有机试剂用量少、易于操作以及染料木素提取率高的特点，同时mofs封装的柚苷酶可多次循环使用，降低了生产成本。

2、为实现上述目的，本技术采用如下技术方案：

3、s1、将原料槐角干燥，粉碎，得到槐角粉末；

4、s2、将槐角粉末放入提取罐中，加入水，升温，在设定温度下进行多次提取，得到槐角苷提取液；

5、s3、将槐角苷提取液加热浓缩得到槐角苷浓缩液；

6、s4、槐角苷浓缩液冷却后，加入mofs封装的柚苷酶，保温搅拌后一段时间后，启动磁场，将mofs封装的柚苷酶吸附于罐壁上，过滤收集滤饼；

7、s5、将滤饼用溶剂浸泡后，加入活性炭脱色，过滤得到染料木素溶液；

8、s6、将染料木素溶液加热浓缩后，放置冷却让其重结晶，将晶体过滤、洗涤、粉碎、干燥后得到染料木素成品。

9、进一步地，s1中槐角粉末的目数在10-30目。

10、通过粉碎，可有效破坏槐角果皮中的纤维素、半纤维素等致密结构，增大物料与提取溶剂的接触面积，使热水快速渗透进颗粒内部，加快槐角苷的溶解与扩散，提高提取效率。如果原料不粉碎或目数过低，会导致内部有效成分难以接触溶剂，提取效率偏低。

11、将目数上限控制在30目，是防止目数过大带来粉尘污染和设备堵塞问题。当物料目数过大时，细料在投料和转移过程中会产生大量粉尘飞扬，造成操作环境恶化；过细粉末在提取和过滤阶段易形成高黏度浆料、堵塞滤布，导致过滤阻力增大、滤液通量下降，影响生产连续性并增加维护成本。

12、进一步地，s2中每次所加入的水质量为槐角粉末质量的3-8倍。

13、进一步地，s2中提取温度为85-90℃；s2中单次提取时间为1-3h；s2中多次提取的次数为3-5次。

14、热水提取温度设置在85-90℃，此范围内热水可有效软化植物组织、破坏细胞壁结构，使槐角苷充分释放并溶解于水中，同时避免了温度过高接近沸点时有效成分的氧化降解。若温度过低，水的渗透能力和溶解能力不足，使槐角苷溶解不充分，提取效率显著下降。该提取时间和提取次数设定，可使绝大部分槐角苷在此条件下充分溶解在溶液中，过少则提取不充分，原料浪费；过多则边际效益递减，增加生产成本。

15、进一步地，s3中加热浓缩的温度为65-75℃。

16、若浓缩温度过高，染料木素及槐角苷等糖苷类成分中的酚羟基在高温下易发生氧化、聚合或分解反应，导致有效成分降解，产品提取率下降、杂质增加；同时高温下容器壁面易形成局部过热区，料液中有机物在加热面发生碳化结焦，既造成目标产物损失、提取率降低，又影响传热效率。若浓缩温度过低，则溶液浓缩时间延长，设备利用率与生产效率降低。

17、进一步地，s3中加热浓缩后的槐角苷浓缩液的比重为1.02-1.05。

18、进一步地，s4中加入mofs封装的柚苷酶的温度为43-47℃；s4中加入mofs封装的柚苷酶的质量为槐角苷浓缩液质量的1-3%；s4中保温搅拌时间为15-24h。

19、柚苷酶在此工艺中起到核心的定向水解转化作用。柚苷酶并非单一酶，而是α-l-鼠李糖苷酶和β-d-葡萄糖苷酶组成的复合酶系。其作用机理为：（1）α-l-鼠李糖苷酶首先作用于槐角苷分子末端的鼠李糖基，将其水解脱落，生成普鲁宁和鼠李糖；（2）β-d-葡萄糖苷酶作用于普鲁宁，将其分子上的剩余的葡萄糖基水解脱落，最终释放出染料木素和葡萄糖。

20、这一水解过程具有高度专一性，可将水溶性的糖苷转化为脂溶性更强的苷元，从而提升后续溶剂萃取的效率，大幅提高产物活性。与传统酸水解相比，柚苷酶酶解条件温和，避免了强酸对产物结构的破坏，同时减少了废酸的产生；与纤维素破壁酶相比，柚苷酶直接作用于目标底物的糖苷键，实现一步转化，无需额外的操作步骤。同时柚苷酶来源广泛，可通过黑曲霉、米曲霉等真菌工业发酵产生，质量稳定可控，便于大规模应用。

21、采用mofs封装相较传统方法（如吸附、共价结合）的区别在于酶是原位包埋于mofs晶体内部，将酶物理固定，相较于传统方法可有效解决酶流失的问题。同时mofs骨架为酶提供了物理屏障和温和的微环境，能有效保护酶的活性。

22、进一步地，mofs封装的柚苷酶制备包括以下步骤：

23、t1、将柚苷酶溶液、锌盐溶液与磁性四氧化三铁，在室温下混合搅拌10-30min；

24、t2、向体系中加入2-甲基咪唑溶液，在20-35℃下搅拌30-60min；

25、t3、将反应产物过滤、洗涤、干燥得到mofs封装的柚苷酶。

26、该固定化的核心策略是以柚苷酶自身为成核模板，利用其表面丰富的羧基与氨基官能团，优先构建富含锌离子预成核簇，随后加入2-甲基咪唑溶液触发配位自组装，在柚苷酶周围构建mofs骨架。与传统吸附法相比，该方法将酶牢固的锁在mofs晶格内部，有效解决了酶泄漏的问题。

27、磁性四氧化三铁的引入，赋予材料便捷的磁响应回收能力，反应结束后只需施加外部磁场即可实现固液分离，大幅简化操作流程。该方法反应条件温和，操作简便，有望降低染料木素生产工艺中的用酶成本。

28、进一步地，t1中柚苷酶浓度为50-100g/l；锌盐浓度为10-20g/l；锌盐包括乙酸锌、硫酸锌、氯化锌与柠檬酸锌中的任意一种；柚苷酶、锌盐与磁性四氧化三铁的质量比为60-90:3-10:10-20。

29、进一步地，t2中2-甲基咪唑溶液浓度为10-20g/l；2-甲基咪唑与锌盐的摩尔比为1.1-1.3:1。

30、进一步地，s5中加入的溶剂质量为滤饼质量的20-30倍；s5中加入活性炭的质量为滤饼质量的3-10%；脱色时间为30-90min。

31、进一步地，s5中加入的溶剂包括乙醇与正丙醇中的任意一种。

32、选用醇类作为滤饼的溶解介质，利用染料木素在醇类溶剂中良好的溶解性，将目标产物从滤饼中高效转移至液相体系中，同时将大量水溶性杂质留在固相或水相中，实现目标物与主要杂质的初步分离。与现有技术相比，本技术采用醇类试剂替代传统酸水解法中的氯仿、二氯甲烷等有机溶剂，避免了有毒溶剂残留带来的质量安全隐患。

33、在醇类溶剂浸泡提取后，进一步采用活性炭对提取液进行脱色处理，利用其丰富的多孔结构吸附除去提取液中的残留植物色素、胶质以及部分小分子杂质，有效消除了杂质对结晶的干扰，确保了染料木素以规整晶体形式选择性析出，显著提升了产品的纯度与外观品质。

34、进一步地，s6中加热浓缩后的染料木素溶液质量为加热前的0.2-0.4倍。

35、醇类溶剂浓缩倍数是实现高效结晶分离的关键，选择此比例可确保有效成分与杂质在热溶液中维持完全溶解状态，不会提前析出，同时为后续重结晶创造合适的条件。

36、若浓缩倍数过低，溶液过饱和度急剧增大，不仅目标产物会快速析出，溶液中的色素、胶质以及其他杂质也会因为溶解度饱和而随染料木素一起析出，形成共沉淀或混晶，导致大量杂质包裹在结晶产物中，即使后续重结晶也无法有效去除。若浓缩倍数过高，则溶液中染料木素过饱和度不足，结晶驱动力减弱，大量目标产物残留在母液中无法析出，同时还需额外增加醇类溶剂回收能耗与母液处理成本，导致生产成本上升。

37、有益技术效果：

38、本技术提供了一种从槐角中提取染料木素的工艺。该工艺先将槐角粉碎后用热水提取，将槐角苷等有效成分充分溶解并浓缩，再向浓缩液中加入柚苷酶进行定向酶解转化。与传统酸水解法相比，本技术避免了强酸对产物的破坏和有毒试剂的使用；与酶解辅助提取法相比，柚苷酶直接作用于底物糖苷键实现分子结构的精准转化，而非辅助提取；与原位生物转化法相比，本技术无需额外的微生物发酵产酶工序，酶解时间短，且产物直接存在于液相体系中，易于后续分离纯化。

39、本技术中采用mofs封装酶，有效提升了酶的重复使用稳定性与催化活性。mofs为酶提供了刚性保护壳，提升了其对外部环境的耐受性，同时其多孔结构有利于底物分子快速扩散至酶活性中心，并降低传质阻力，加快反应速率。引入磁性组分后，赋予材料磁响应的特性，可通过外加磁场实现快速固液分离。此外mofs的孔道限域特性能有效防止酶分子的聚集和构象改变，有效解决了传统吸附法中酶易脱落的问题。

40、本技术中醇类溶剂萃取可将染料木素从滤饼有效萃取到有机相中，同时除去大量水溶性杂质；活性炭脱色可有效脱除色素以及大分子杂质，为后续重结晶提供纯净母液；重结晶可制得高纯度产品。整个工艺仅使用水与醇类试剂两种溶剂，避免了氯仿、二氯甲烷等有毒溶剂的使用，绿色环保、设备要求低、操作简便，具有良好的工业化应用前景。

41、综上所述，本技术有效克服了现有技术中酸水解破坏产物，酶解辅助提取不直接转化、原位生物转化产物分离困难等不足，实现了从槐角到高纯度染料木素的高效、绿色的工业化制备。