一种辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞及其构建与应用的制作方法

本发明属于生物医药，尤其涉及一种辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、原发性肺癌是我国及全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, nsclc）约占所有肺癌病例的80%～85%。由于早期肺癌多无明显症状，临床上多数患者确诊时已属中晚期，错失手术根治的最佳时机。对于这部分患者，放射治疗（radiotherapy）是不可或缺的治疗手段，在肺癌的全程管理中发挥着愈来愈重要的作用。

2、然而，在临床实践中，放疗疗效受到辐射抵抗（radiation resistance）的严重制约，包括但不限于：

3、复发率高：尽管放疗技术已取得显著进步，但仍有相当比例的患者在治疗后出现局部复发或远处转移。研究显示，即使给予根治性剂量的放疗，部分肿瘤细胞仍能存活并产生辐射抵抗。

4、机制复杂且未明：放疗抵抗是由多种复杂因素共同作用的结果，包括dna损伤反应异常、细胞周期阻滞、自噬激活、以及肿瘤微环境改变等。目前，关于肺癌放疗抵抗的具体分子机制尚未完全阐明。

5、为了深入研究放疗抵抗机制并筛选有效的放疗增敏剂，构建可靠的体外细胞模型至关重要。现有技术中，辐射抵抗细胞株的构建存在以下局限性：

6、1.诱导方式不合理：部分研究采用大剂量单次冲击（如一次性10gy）来筛选辐射抵抗细胞，这种方法虽然耗时短，但难以复现临床上“低剂量、分次、累积”（通常为2gy/次，每日一次，总剂量60gy左右）的常规分割放疗模式，筛选出的细胞特性可能与临床实际不符。

7、2.辐射源选择局限： 传统的钴-60（co-60）γ射线源存在同位素衰变问题，导致长期筛选过程中剂量率不恒定，影响实验可重复性；而临床用直线加速器（linac）能量过高（mv级），在照射单层细胞时存在明显的“建成效应”，需复杂的补偿物校正，否则极易造成实际吸收剂量误差。

8、因此，构建一株能够模拟临床放疗抵抗特征的细胞系，对于深入揭示放疗抵抗机制、筛选逆转放疗抵抗的新型药物具有重要的临床转化意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明利用人非小细胞肺癌h1299细胞系，采用生物学专用x射线辐照仪进行长期、精准的小剂量分割照射筛选，提供一种辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中缺乏能够模拟临床常规分割放疗诱导特征的肺癌实验模型的难题。本发明获得的辐射抵抗细胞系具有稳定的辐射抵抗性，具有较高的科研和临床应用价值。

2、本发明提供了一种辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系，命名为h1299r。该细胞系是通过在体外利用x射线辐照仪经过多轮次分割照射压力筛选而得，具有稳定的辐射抵抗表型，并提供了细胞系的制备方法和应用。

3、本发明技术方案如下：

4、本发明的第一个目的是提供辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r，该细胞系命名为人非小细胞肺癌细胞h1229r homo sapiens，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2026年1月14日，保藏编号为：cctcc no：c202615。

5、本发明的第二个目的是提供前述的辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r的制备方法，包括以下步骤：

6、(1) 亲本细胞培养：复苏人非小细胞肺癌细胞系h1299作为亲本细胞，在体外进行常规培养，待细胞生长至对数生长期；

7、(2) 体外辐射诱导：利用x射线辐照仪对处于对数生长期的h1299细胞进行照射，单次照射剂量为2gy；

8、(3) 恢复与传代：照射后更换新鲜培养基，待细胞从辐射损伤中恢复并重新生长至汇合度80%-90%时，进行传代；

9、(4) 循环筛选与稳定：重复步骤(2)至(3)的操作过程，累计照射30次，累计总剂量达到60gy；

10、(5) 稳转株建立：末次照射结束后，将存活细胞继续培养并稳定传代，即获得辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r。

11、进一步的，步骤(2)中，所述x射线辐照仪的电压设置为160kv，电流设置为18ma，剂量率为2cgy/s。

12、进一步的，步骤(3)中，所述体外培养的培养基为含有10%胎牛血清的rpmi-1640完全培养基，培养条件为37℃、5% co2。

13、本发明的第三个目的是提供前述人非小细胞肺癌细胞系h1299r在筛选或评价放疗增敏肺癌药物中的应用。

14、本发明的第四个目的是提供前述的辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r在构建肺癌放疗抵抗动物模型中的应用。

15、本发明的第五个目的是提供前述的辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r在研究肺癌放疗抵抗机制或寻找逆转辐射抵抗靶点中的应用。

16、本发明的有益效果：

17、(1) 模拟临床真实性高：采用“2gy×30次”累计60gy的方案，高度还原了临床根治性放疗的剂量分割模式，筛选出的辐射抵抗细胞株更能反映获得性辐射抵抗的生物学本质。

18、(2) 诱导剂量精准可控：本发明使用x射线辐照仪进行诱导。相比于钴-60，其消除了放射源衰变带来的剂量率波动误差；相比于临床直线加速器，其采用的低能x射线（kv级）更适合细胞培养物的厚度，无需复杂的建成区补偿即可保证细胞层面的吸收剂量均匀性和准确性，显著提高了辐射抵抗细胞株构建的稳定性和可重复性。

19、(3) 辐射抵抗表型稳定：构建的h1299r细胞系在体外克隆形成实验和体内裸鼠移植瘤模型中，均表现出显著且稳定的辐射抵抗特性。

1.辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r，其特征在于，该细胞系命名为人非小细胞肺癌细胞h1229r homo sapiens，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2026年1月14日，保藏编号为：cctcc no：c202615。

2.权利要求1所述的辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述x射线辐照仪的电压设置为160kv，电流设置为18ma，剂量率为2cgy/s。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述体外培养的培养基为含有10%胎牛血清的rpmi-1640完全培养基，培养条件为37℃、5% co2。

5.权利要求1所述人非小细胞肺癌细胞系h1299r在筛选或评价放疗增敏肺癌药物中的应用。

6.权利要求1所述的辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r在构建肺癌放疗抵抗动物模型中的应用。

7.权利要求1所述的辐射抵抗的人非小细胞肺癌细胞系h1299r在研究肺癌放疗抵抗机制或寻找逆转辐射抵抗靶点中的应用。