用于犬间充质干细胞培养的培养基及培养方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种大量制备间充质干细胞及其外泌体的方法。

背景技术：

1、近年来，随着再生医学和组织工程的发展，干细胞在兽医临床的应用成为研究的热点。干细胞（stemcells，scs）在医学界称之为“万用细胞”，在不同的培养条件下，scs能分化为肌上皮细胞、骨细胞、软骨细胞、多巴胺能神经元和乙酰胆碱能神经元等。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，mscs）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞。mscs来源于中胚层间充质，大多存在于器官间质和结缔组织中，动物体骨髓中的含量最多。现在研究最热的mscs主要来源于骨髓、脐带、外周血、牙齿和脂肪组织等。mscs具有取材方便，能够迅速扩增，并在扩增过程中保持多向分化潜能，同时在特定的环境下分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等优点。间充质干细胞凭借其卓越的多向分化潜能、免疫调节特性及低免疫原性，已成为兽医临床治疗骨关节疾病、神经损伤及代谢性疾病的关键生物资源，其衍生的外泌体更代表了无细胞治疗的新前沿。

2、随着宠物经济的走红，饲养者对于宠物的健康更加关注，且近年来，犬的皮炎、肌肉、骨骼和关节软骨疾病出现增多，但现有治疗方案的效果并不理想，需要更有效的治疗方法。犬间充质干细胞在兽医领域展现出巨大的治疗潜力，mscs具有多向分化潜能，具有免疫原性较低，增殖能力强的特点，这加速了cmscs在组织工程上的研究与应用。然而，面对需求的激增，如何大量获得犬间充质干细胞以及减少间充质干细胞使用过程中的排异反应成为目前研究的热点问题。

3、外泌体是细胞分泌到细胞外空间的单层膜囊泡，直径一般在30～150nm之间。多种细胞在任意状态下均可分泌exos。外泌体携带复杂的物质，包括细胞类型的特定蛋白质，核酸和脂质，具有独特的生物活性。近年来，外泌体作为一种重要的细胞间通讯载体被广泛研究，它既能影响邻近细胞，也能影响身体的其他部位。间充质干细胞外泌体（mscs-exos）在修复器官的损伤具有出色的修复效果，其在组织损伤治疗中发挥了很大作用。外泌体含有多种生物活性物质包含microrna、mrna、非编码rna、膜蛋白和细胞质、脂质、细胞因子、生长因子等，在免疫反应、免疫调节、炎症反应和干细胞表型转化中发挥着重要作用。

4、与mscs相比，纳米级mscs-exos具有颗粒更小、靶向结合、保存稳定、免疫反应安全、高效、临床可通过的特点，因此，mscs-exos有望成为一种新的给药途径和基因治疗载体具有广阔的临床应用前景。外泌体的功能取决于源细胞类型和细胞的培养状态，大量获得外泌体也是制药成功和大规模商业化应用的前提。

技术实现思路

1、本发明旨在解决兽药制药过程中难以大量获取间充质干细胞及其外泌体的技术问题，提供一种间充质干细胞培养基，其利于间充质干细胞的快速增殖，并且能够促进间充质干细胞产生外泌体。

2、为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明请求保护一种用于犬间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，该培养基是以dmem培养基为基础，添加无外泌体血清，进一步添加谷氨酸和/或氯化钴。

4、优选地，所述培养基是以dmem培养基作为基础培养基，添加10%体积百分比的无外泌体胎牛血清，0.5ng/ml的谷氨酸和/或0.2ng/ml的氯化钴。

5、优选地，所述培养基是以dmem培养基作为基础培养基，添加10%体积百分比的无外泌体胎牛血清，0.5ng/ml的谷氨酸和0.2ng/ml的氯化钴。

6、优选地，所述无外泌体胎牛血清采用如下方法制备得到：将胎牛血清进行120000g超速离心4h后，弃沉淀，即得无外泌体胎牛血清。

7、优选地，所述犬间充质干细胞是犬骨髓间充质干细胞。

8、本发明还请求保护一种犬骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，采用上述用于犬间充质干细胞培养的培养基进行培养。

9、本发明还请求保护一种犬骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，采用上述方法培养获得犬骨髓间充质干细胞培养物进行外泌体的提取。

10、优选地，所述外泌体提取方法包括如下步骤：

11、（1）将收集的犬骨髓间充质干细胞培养上清液4℃，3000g离心，20min，以去除残留的死细胞和细胞碎片；

12、（2）将样品量与外泌体沉淀试剂eps-c按照2：1混合，并将样本与eps-c颠倒混匀，2~8℃下静置过夜；

13、（3）取出离心管观察，标记好沉淀位置。将离心管放在离心机中，4℃离心，10000g，30min，沉淀外泌体；

14、（4）弃去上清，收集沉淀，10000g离心5min，用200μl枪头小心吸去剩余上清，10000g离心5min，换用10μl的枪头小心吸去剩余上清，将上清尽可能的吸弃干净；

15、（5）向沉淀中加入30μl ers-c溶液，用移液器轻轻吹打并重悬沉淀，即得外泌体。若外泌体沉淀过多，可增加重悬液的量至沉淀完全溶解。

16、基于以上技术方案，本发明具有如下有益效果：

17、本发明的培养基以dmem为基础，添加无外泌体胎牛血清及0.5ng/ml谷氨酸、0.2ng/ml氯化钴，二者协同促进犬间充质干细胞快速增殖（提前2天进入对数生长期，群体倍增时间缩短约33%），并通过促进细胞增殖与促进单位细胞外泌体分泌的双重机制，使培养上清中外泌体产量提高约1.1倍；同时，无外泌体血清的使用排除了血清外泌体干扰，保证了外泌体的纯度与批次稳定性；配套的沉淀法提取工艺无需超速离心，操作简便、成本低廉。本发明有效解决了兽药制药过程中难以大量获取犬间充质干细胞及其外泌体的技术问题，为其规模化、产业化应用奠定了基础。

1.一种用于犬间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，该培养基是以dmem培养基为基础，添加无外泌体血清，进一步添加谷氨酸和/或氯化钴。

2.根据权利要求1所述的用于犬间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，所述培养基是以dmem培养基作为基础培养基，添加10%体积百分比的无外泌体胎牛血清，0.5ng/ml的谷氨酸和/或0.2ng/ml的氯化钴。

3.根据权利要求2所述的用于犬间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，所述培养基是以dmem培养基作为基础培养基，添加10%体积百分比的无外泌体胎牛血清，0.5ng/ml的谷氨酸和0.2ng/ml的氯化钴。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于犬间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，所述无外泌体胎牛血清采用如下方法制备得到：将胎牛血清进行120000g超速离心4h后，弃沉淀，即得无外泌体胎牛血清。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的用于犬间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，所述犬间充质干细胞是犬骨髓间充质干细胞。

6.一种犬骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，采用上述权利要求1-3任意一项所述的用于犬间充质干细胞培养的培养基进行培养。

7.一种犬骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，采用上述权利要求6所述的方法培养获得犬骨髓间充质干细胞培养物后进行外泌体的提取。

8.根据权利要求7所述的犬骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述外泌体提取方法包括如下步骤：