一种化学成分限定的间充质干细胞培养基及其二维细胞培养应用的制作方法

本发明属于细胞培养，具体涉及一种间充质干细胞化学成分限定培养基及其应用。

背景技术：

1、间充质干细胞是是一种具有自我更新和向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多向分化能力的多潜能干细胞，可以与许多细胞类型相互作用，通过细胞间接触或可溶性因子分泌来调节先天免疫系统和适应性免疫系统，调节组织微环境，促进组织再生，是临床治疗中使用最普遍和实验研究最广泛的成人多能干细胞之一。间充质干细胞可以从多种组织中获得，如骨髓、脂肪组织、脐带、皮肤、毛囊、牙髓和外周血，但是间充质干细胞在所有这些组织中所占比例都很低，如人骨髓间充质干细胞仅占总骨髓单核细胞的0.001％-0.01％，并且细胞数目随着供体年龄增长而降低。然而msc临床应用需要大量细胞，为了满足生物学研究和临床应用的需求，人们正在寻找体外大规模扩增间充质干细胞的科学手段。使用有效和安全的方法，在较短的时间内保持间充质干细胞的关键特性，以避免细胞老化和污染，同时达到体外扩增的目的。

2、为了促进间充质干细胞生物学从基础研究向临床应用的转变，我们需要进一步发展体外扩增间充质干细胞的试剂和设备，其中最重要就是化学成分限定培养基的开发和完善。相对于含有血清替代因子的间充质干细胞培养基，化学成分限定培养基可以提供标准化配方，减轻了污染、成本、批次差异性和伦理争议等问题。化学成分限定培养基主要由基础培养基和添加因子组成。基础培养基包含了维持细胞生长代谢所必需的葡萄糖、氨基酸、维生素和无机盐等，添加因子包括激素、生长因子、结合蛋白、粘附因子、微量元素、氨基酸、核苷酸、脂类、维生素、糖类、多胺类、有机酸、还原剂和缓冲系统等。市场现售的人间充质干细胞无血清培养基，价格昂贵，但培养效果却不甚理想，干细胞增殖速度以及培养后干细胞表面标记物的表达均低于血清培养基。

3、阿司匹林是乙酰水杨酸化合物，由水杨酸(邻羟基苯甲酸)与醋酸酐进行酯化反应而得，被广泛用于治感冒、发热、头痛、牙痛、关节痛、风湿病，还能抑制血小板聚集，用于预防和治疗缺血性心脏病、心绞痛、心肺梗塞、脑血栓形成，应用于血管形成术及旁路移植术。除此之外，阿司匹林还可以治疗或延缓老年痴呆症、帕金森病等神经退行性疾病，对直结肠癌的预防和治疗也有一定的作用。多项研究数据证实了阿司匹林在多种组织细胞中抑制环氧酶cox-2以及细胞活性氧水平，为阿司匹林应用于临床实现延缓人类衰老提供了理论依据。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供新型的间充质干细胞化学成分限定培养基，该培养基化学成分明确，无蛋白水解成分和血清替代因子等，促进间充质干细胞高效扩增，解决间充质干细胞临床应用的安全性问题。

2、第一方面，本发明提供了一种间充质干细胞限定成分培养基，由基础培养基和添加成分组成。所述基础培养基选自imdm、α-mem、高糖dmem、dmem/f12、1640中的一种或多种，优选imdm；imdm提供了细胞生长基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、核酸衍生物等。所述添加成分选自结合蛋白类物质、粘附因子类物质、激素类物质、维生素类物质、有机酸类物质、氨基酸类物质、糖类物质、生长因子类物质、含微量元素物质、核苷类物质、生物胺类物质、阿司匹林、大豆胰酶抑制剂中的一种或多种，添加成分为细胞提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。

3、其中，结合蛋白可以促进细胞的生长，同时也是一些有害微量元素的螯合剂。结合蛋白类物质选自转铁蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种。人血清白蛋白是一种重要的营养物质，其分解产生的氨基酸、能量或其他含氮物质为细胞生长代谢提供物质基础。此外，人血清白蛋白可以为细胞提供合适的ph和渗透压，维持细胞生长的渗透压平衡，避免细胞遭受ph波动和机械力损伤，还与培养基中激素、生长因子、维生素、脂类和金属离子可逆结合，作为载体发挥稳定和调节的上述活性物质的作用。转铁蛋白能够结合并转运铁离子，为细胞代谢提供所需的铁元素。同时，转铁蛋白还具有抗菌活性，维持细胞增殖和分化等。

4、其中，粘附因子可以促进细胞的黏连生长，显著提高细胞的贴壁率，维持细胞形态结构，增强细胞代谢，促进遗传物质合成，提高原代细胞培养的成活率，大大缩短细胞生长时间。粘附因子类物质选自纤粘蛋白。

5、其中，激素在细胞生长、代谢、信号传导等方面十分重要，如胰岛素在哺乳动物细胞的合成和代谢方面起重要作用，可以促进细胞增殖。激素类物质选自胰岛素、甲状旁腺激素、雌二醇、孕酮、氢化可的松、地塞米松中的一种或多种。胰岛素能够调节葡萄糖和脂质代谢、基因表达、蛋白质合成以及细胞生长、分裂和存活等关键生物过程。甲状旁腺激素可以调节细胞外液中钙离子浓度。类固醇激素可自由进入细胞，激活细胞内的核受体，调控基因转录，从而影响心血管系统和骨骼肌肉系统等发育。地塞米松、氢化可的松参与间充质干细胞的糖类、脂类等成分的代谢，并参与干细胞免疫抑制。

6、其中，维生素作细胞培养基的生长补充剂，具有抗氧化和抗老化的效果，消除过氧化物和致病自由基以保护细胞，用于增加间充质干细胞的生长和活力。维生素类物质选自括维生素a和维生素c中的一种或多种。

7、其中，所述有机酸类物质选自牛磺酸、丙酮酸中的一种或多种；牛磺酸具有抗氧化作用、稳定细胞膜作用、保持细胞ca2+稳定的作用，积极发挥细胞保护效应。化学成分确定的培养基中加入牛磺酸还可以增加感兴趣蛋白的产量。丙酮酸是一种酸性较弱的有机酸，将其添加到培养基中为合成代谢过程提供能量来源和碳的骨架。丙酮酸的加入有助于在血清浓度降低时维持细胞状态，有助于克隆增殖；丙酮酸还是过氧化物清除剂，具有防止自由基损伤的作用。

8、其中，所述氨基酸类物质选自非必须氨基酸，非必需氨基酸(nonessential aminoacids)包括了丙氨酸(l-alanine)、天冬氨酸(l-aspartic acid)、天冬酰胺(l-asparagine)、谷氨酸(l-glutamic acid)、脯氨酸(l-proline)、丝氨酸(l-serine)、甘氨酸(glycine)。在细胞培养基中添加适当浓度的非必需氨基酸能减轻细胞在合成方面的负担，提高其他营养成分的利用率。

9、其中，所述糖类物质选自果糖，果糖是一种葡萄糖结构异构体，因为它的摄取和利用受到更严格的控制，可以成为替代碳源，以供细胞新陈代谢。

10、其中，生长因子通常能和靶细胞膜上特异性受体结合，进而影响细胞有丝分裂、蛋白质合成及分化，是维持细胞体外生长增殖、分裂分化所必需的生物补充因子，如转化生长因子能够维持干细胞的自我更新能力及分化潜能。生长因子类物质选自血小板衍生因子pdgf-bb、表皮生长因子egf、转化生长因子tgf-β1和tgf-β3、成纤维细胞生长因子b-fgf、类胰岛素生长因子igf-i、血管内皮生长因子vegf、结缔组织生长因子ctgf、肝细胞生长因子hgf、白血病抑制因子lif、白细胞介素类生长因子il-2等、促红细胞生成素epo、干细胞生长因子scf、肿瘤坏死因子tnf-α中的一种或多种，多种生长因子协同作用刺激间充质干细胞增殖和分化。

11、其中，微量元素如硒是其中最常见的，硒是一种生命必需的微量元素，参与抗氧化酶(如谷胱甘肽过氧化物酶-gpx、硫氧还原酶-trxr以及三种脱碘酶-d1、d2、d3)的作用过程，具有强大的抗氧化活性，抵御过氧化物和超氧化物对细胞的损伤。含微量元素物质选自亚硒酸钠。

12、其中，核苷是构成dna的物质基础，参与细胞遗传物质和蛋白质合成，提供能量以维持细胞代谢等。核苷类化合物选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷中的一种或多种。

13、其中，生物胺在刺激细胞生长中起重要作用，可以延长细胞的周期，发挥抗凋亡作用，提高细胞的增殖密度。生物胺类物质选自乙醇胺、腐胺中的一种或多种，胺可以合成精胺，稳定dna分子；乙醇胺能够促进细胞膜的构建。

14、其中，阿司匹林具有抗衰老的作用，被广泛用于改善健康和延长寿命，可以提高细胞增殖活力。

15、其中，大豆胰酶抑制剂，是抗蛋白酶成分，起到中和作用，终止传代过程中胰蛋白酶的消化作用。

16、优选的，本发明间充质干细胞化学成分限定培养基中的添加剂的成分和含量可以是：重组人血清白蛋白0.5～50g/l、重组人转铁蛋白0.1～10mg/l、重组人纤连蛋白fn 0～100mg/l、胰岛素1～100mg/l、孕酮0～50μg/l、雌二醇0～50μg/l、地塞米松1～150μg/l、氢化可的松0.05～5mg/l、甲状旁腺激素0～10μg/l、维生素a 0-1000μm、维生素c 25～2000mg/l、非必须氨基酸neaa 0-500mg/l、牛磺酸0～50mg/l、丙酮酸0-500mg/l、腐胺0～100mg/l、氨基乙醇0.5～50mg/l、亚硒酸钠2.0～100μg/l、大豆胰酶抑制剂0～100mg/l、表皮生长因子(egf)1～500μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)1～500μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)1～500μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)1～500μg/l、血管内皮生长因子(vegf)0～500μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)1～500μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)0～500μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)0～500μg/l、干细胞因子(scf)0～500μg/l、肝细胞生长因子(hgf)0～500μg/l、白细胞介素-2(il-2)0～500μg/l、白血病抑制因子(lif)0～500μg/l、促红细胞生成素(epo)0～100μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)0～100μg/l、脱氧腺苷0～500mg/l、脱氧胞苷0～500mg/l、脱氧鸟苷0～500mg/l、果糖0～500mg/l、阿司匹林0-100μm。更优选的，添加剂的成分和含量为：重组人血清白蛋白1.25g/l、重组人转铁蛋白5.5mg/l、胰岛素10mg/l、地塞米松100μg/l、氢化可的松0.36mg/l、维生素c 100mg/l、氨基乙醇2mg/l、亚硒酸钠10μg/l、表皮生长因子(egf)20μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)20μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)20μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)20μg/l。

17、优选的，本发明间充质干细胞化学成分限定培养基中的添加剂的成分和含量还可以是：重组人血清白蛋白0.5～50g/l、重组人转铁蛋白0.1～10mg/l、重组人纤连蛋白fn 1～100mg/l、胰岛素1～100mg/l、孕酮0.5～50μg/l、雌二醇0.5～50μg/l、地塞米松1～150μg/l、氢化可的松0.05～5mg/l、甲状旁腺激素0.1～10μg/l、维生素a10-1000μm、维生素c 25～2000mg/l、非必须氨基酸neaa 1-500mg/l、牛磺酸0.5～50mg/l、丙酮酸1-500mg/l、腐胺2～100mg/l、氨基乙醇0.5～50mg/l、亚硒酸钠2.0～100μg/l、大豆胰酶抑制剂1～100mg/l、表皮生长因子(egf)1～500μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)1～500μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)1～500μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)1～500μg/l、血管内皮生长因子(vegf)1～500μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)1～500μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)1～500μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)1～500μg/l、干细胞因子(scf)1～500μg/l、肝细胞生长因子(hgf)1～500μg/l、白细胞介素-2(il-2)1～500μg/l、白血病抑制因子(lif)1～500μg/l、促红细胞生成素(epo)0.1～100μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)0.1～100μg/l、脱氧腺苷1～500mg/l、脱氧胞苷1～500mg/l、脱氧鸟苷1～500mg/l、果糖0～500mg/l、阿司匹林0-100μm。更优选的，添加剂的成分和含量为：重组人血清白蛋白1.25g/l、重组人转铁蛋白5.5mg/l、重组人纤连蛋白fn 2mg/l、胰岛素10mg/l、孕酮2.7μg/l、雌二醇1.3μg/l、地塞米松100μg/l、氢化可的松0.36mg/l、甲状旁腺激素35.74μg/l、维生素a 50μm、维生素c100mg/l、非必须氨基酸neaa 10mg/l、牛磺酸1.25mg/l、丙酮酸50mg/l、腐胺5.3mg/l、氨基乙醇2mg/l、亚硒酸钠10μg/l、大豆胰酶抑制剂1mg/l、表皮生长因子(egf)20μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)20μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)20μg/l、血管内皮生长因子(vegf)20μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)20μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)20μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)20μg/l、干细胞因子(scf)20μg/l、肝细胞生长因子(hgf)20μg/l、白细胞介素-2(il-2)10μg/l、白血病抑制因子(lif)20μg/l、促红细胞生成素(epo)10μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)10μg/l、脱氧腺苷10mg/l、脱氧胞苷11mg/l、脱氧鸟苷10mg/l。

18、优选的，本发明间充质干细胞化学成分限定培养基中的添加剂的成分和含量也可以是：重组人血清白蛋白0.5～50g/l、重组人转铁蛋白0.1～10mg/l、重组人纤连蛋白fn 1～100mg/l、胰岛素1～100mg/l、孕酮0.5～50μg/l、雌二醇0.5～50μg/l、地塞米松1～150μg/l、氢化可的松0.05～5mg/l、甲状旁腺激素0.1～10μg/l、维生素a10-1000μm、维生素c 25～2000mg/l、非必须氨基酸neaa 1-500mg/l、牛磺酸0.5～50mg/l、丙酮酸1-500mg/l、腐胺2～100mg/l、氨基乙醇0.5～50mg/l、亚硒酸钠2.0～100μg/l、大豆胰酶抑制剂1～100mg/l、表皮生长因子(egf)1～500μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)1～500μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)1～500μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)1～500μg/l、血管内皮生长因子(vegf)1～500μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)1～500μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)1～500μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)1～500μg/l、干细胞因子(scf)1～500μg/l、肝细胞生长因子(hgf)1～500μg/l、白细胞介素-2(il-2)1～500μg/l、白血病抑制因子(lif)1～500μg/l、促红细胞生成素(epo)0.1～100μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)0.1～100μg/l、脱氧腺苷1～500mg/l、脱氧胞苷1～500mg/l、脱氧鸟苷1～500mg/l、果糖1～500mg/l、阿司匹林1-100μm。更优选的，添加剂的成分和含量为：重组人血清白蛋白1.25g/l、重组人转铁蛋白5.5mg/l、重组人纤连蛋白fn 2mg/l、胰岛素10mg/l、孕酮2.7μg/l、雌二醇1.3μg/l、地塞米松100μg/l、氢化可的松0.36mg/l、甲状旁腺激素35.74μg/l、维生素a 50μm、维生素c100mg/l、非必须氨基酸neaa 10mg/l、牛磺酸1.25mg/l、丙酮酸50mg/l、腐胺5.3mg/l、氨基乙醇2mg/l、亚硒酸钠10μg/l、大豆胰酶抑制剂1mg/l、表皮生长因子(egf)20μg/l、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/l、血小板源性生长因子bb(pdgf-bb)20μg/l、胰岛素样生长因子-i(igf-i)20μg/l、血管内皮生长因子(vegf)20μg/l、转化生长因子β1(tgf-β1)20μg/l、转化生长因子β3(tgf-β3)20μg/l、结缔组织生长因子(ctgf)20μg/l、干细胞因子(scf)20μg/l、肝细胞生长因子(hgf)20μg/l、白细胞介素-2(il-2)10μg/l、白血病抑制因子(lif)20μg/l、促红细胞生成素(epo)10μg/l、肿瘤坏死因子α(tnf-α)10μg/l、脱氧腺苷10mg/l、脱氧胞苷11mg/l、脱氧鸟苷10mg/l、果糖20mg/l、阿司匹林10μm。

19、第二方面，本发明还提供了间充质干细胞化学成分限定培养基的制备方法，如下：本发明提供了一种间充质干细胞限定成分培养基的制备方法：将除了基础培养基外的其他组分按比例混合，制得添加组剂b，制得的添加组剂b加入到基础培养基组剂中，制得间充质干细胞化学成分限定培养基。

20、第三方面，本发明还提供了间充质干细胞化学成分限定培养基用于二维实验培养的应用。其二维培养实验步骤如下：将水浴锅预热至37℃，提前取出适量配置好的限定成分培养基复温。取出冻存的人脐带间充质干细胞，置入37℃水浴锅中快速解冻。立即吸取细胞悬液至15ml离心管中，逐滴加入10ml恢复至室温的限定成分培养基，轻柔混匀。离心，弃上清，加入3～5ml限定成分培养基基重悬细胞，精确计数。按照合适的接种密度(6000-8000/cm2推荐8000/cm2)将细胞接种到细胞培养容器中，加入适量限定成分培养基。置于37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱连续培养3-4天，细胞汇合度80-85％可选择传代或收获。细胞传代时使用基因工程胰酶消化收集细胞，按照合适的接种密度(6000-8000/cm2推荐8000/cm2)将细胞接种到细胞培养容器中，加入适量限定成分培养基继续培养。

21、本发明的有益效果

22、(1)本发明所述培养基化学成分明确，无蛋白水解成分和血清替代因子等，避免血清或血替成分带来的不稳定性、病源污染等风险，解决间充质干细胞临床应用的安全性问题。

23、(2)本发明的培养基添加了阿司匹林抗衰老成分，促进间充质干细胞高效扩增，减小细胞直径，维持细胞高活性状态。