一种靶向PSMA的双模态探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药，具体地，涉及一种靶向psma的双模态探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、前列腺癌（prostate cancer, pca）是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。近年来前列腺癌的发病率呈现出逐步上升的趋势。前列腺癌的早期发现和处理对患者而言尤为重要。根治性前列腺癌切除术是治疗局限性及局部进展期的前列腺癌最有效的方法之一。但由于术中肿瘤边界、淋巴结转移以及微小的肿瘤与正常组织无法用肉眼区别，导致术中肿瘤组织切除不彻底。肿瘤的不完全切除会导致切缘阳性的发生，而切缘阳性被认为是不利的病理学特征，可能导致前列腺癌的生化复发。目前手术切缘阳性成为外科医生经常面对的问题之一。为此亟需开发出术中能够实时定位肿瘤，实现肿瘤边界可视化的术中导航工具。

2、psma是一种ⅱ型膜蛋白，在前列腺癌细胞表面过表达，是前列腺癌特异性分子标志。靶向psma小分子抑制剂是目前研究和应用较多的psma配体，其主要结构是谷氨酸-脲及其类似物glu-urea-r。和能与机体产生免疫不良反应且背景清除缓慢的抗体相比，基于psma配体开发的探针表现出更好的药代动力学特性和安全性。

3、荧光成像因具有高灵敏度的特点被用于检测恶性肿瘤。利用荧光成像的便携性充分与手术技术相结合来精确导航手术的技术逐渐进入临床实践，通过肿瘤组织中积累荧光染料达到肿瘤实时可视化的目的。正电子发射断层扫描（positron emission computedtomography, pet）成像检测因具有足够的穿透深度和高灵敏度，弥补了近红外荧光成像光信号组织穿透能力较弱的短板，但其具有放射性和较短的核素半衰期，而近红外荧光成像（near-infrared fluorescence imaging, nirf）又恰好能够补充实时成像的功能。因此，开发一种pet/nirf双模态成像可以实现术前和术中肿瘤检测一体化，对于前列腺癌的术前诊断和前列腺根治术的术中导航都具有重要意义。

技术实现思路

1、为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种靶向psma的双模态探针及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种靶向psma的荧光探针，所述荧光探针具有如式（ⅰ）所示的结构：

4、

5、式（ⅰ）

6、其中，r为核素螯合基团；f为荧光基团。

7、在一些实施方案中，所述核素螯合基团是含有两个或以上配位原子的多齿配体，能与金属离子形成环状络合物。其稳定性源于螯合效应（多齿配体形成的络合物比单齿配体更稳定）和大环效应（大环配体因供体原子预组织减少络合时的熵损失，稳定性更高）。

8、进一步，所述核素螯合基团为双功能螯合剂形成的基团，所述双功能螯合剂为dota、nota、noda、nodaga、dotp、teta、atsm、ptsm、edta、ec、hbedcc、dtpa、bapen、df、dfo、tacn、no2a、notam、cb-do2a、cyclen、do3a、do3ap、hynic、mas3、mag3或异腈中的一种或多种。

9、在一些实施方案中，所述荧光基团是一种荧光化合物，在光激发下可以重新发光。荧光团通常包含多个组合的芳香族基团，或具有多个π键的平面或环状分子。其中，近红外（near-infrared，nir）荧光基团是生物体内常用的荧光基团之一，分为近红外i区（nir-i,650-900 nm）和近红外ⅱ区（nir-ii, 1000-1700 nm）荧光染料，因其波长更长，可降低生物机体荧光对检测的干扰，很大程度上提高检测限及灵敏度。也因其侵袭性、实时、分辨率高等优势，nir荧光探针广泛应用于生物大分子标记、肿瘤研究等研究领域。近红外基团包括：ir系列、cy系列、icg系列、ec系列、ch1055系列。

10、进一步，所述荧光基团为近红外荧光基团，所述近红外荧光基团为近红外一区和/或近红外二区荧光基团。

11、进一步，所述核素螯合基团具有如式（ⅱ）所示的结构，所述荧光基团具有如式（ⅲ）所示的结构：

12、

13、式（ⅱ）

14、

15、式（ⅲ）。

16、进一步，所述荧光探针具有式（ⅳ）所示的结构：

17、

18、式（ⅳ）。

19、本发明第二方面提供了一种靶向psma的核素/荧光双模态探针，所述双模态探针为放射性核素标记的本发明第一方面所述的荧光探针。

20、在一些实施方案中，所述放射性核素又称作放射性同位素，是指原子核不稳定、具有放射性的核素。放射性核素会发生放射性衰变，放出电离辐射（如α射线、β射线、γ射线等），衰变成其他核素。根据来源可将放射性核素分为天然放射性核素和人造放射性核素，其中天然放射性核素包括原始放射性核素、次生天然放射性核素和天然核反应生成的放射性核素。

21、进一步，所述放射性核素包括68ga、64cu、18f、86y、90y、89zr、111in、99mtc、11c、123i、125i、124i、177lu、125i、131i、211at、111in、153sm、186re、188re、67cu、212pb、225ac、213bi、212bi和212pb中的至少一种。

22、进一步，所述放射性核素为68ga。

23、本发明第三方面提供了一种靶向psma的荧光探针或核素/荧光双模态探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：以化合物1为底物，加入荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物1为euk与ahx-oh、lys(dde)-oh、phe-oh、3-iodo-tyr(otbu)-oh、gly-oh、dota-(coot-bu)3、asp(otbu)-oh反应后得到的产物。

24、进一步，所述方法包括以下步骤：以化合物2为底物，加入asp(otbu)-oh和荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物2为euk与ahx-oh、lys(dde)-oh、phe-oh、3-iodo-tyr(otbu)-oh、gly-oh、dota-(coot-bu)3反应后得到的产物。

25、进一步，所述方法包括以下步骤：以化合物3为底物，加入dota-(coot-bu)3、asp(otbu)-oh和荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物3为euk与ahx-oh、lys(dde)-oh、phe-oh、3-iodo-tyr(otbu)-oh、gly-oh反应后得到的产物。

26、进一步，所述方法包括以下步骤：以化合物4为底物，加入gly-oh、dota-(coot-bu)3、asp(otbu)-oh和荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物4为euk与ahx-oh、lys(dde)-oh、phe-oh、3-iodo-tyr(otbu)-oh反应后得到的产物。

27、进一步，所述方法包括以下步骤：以化合物5为底物，加入3-iodo-tyr(otbu)-oh、gly-oh、dota-(coot-bu)3、asp(otbu)-oh和荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物5为euk与ahx-oh、lys(dde)-oh、phe-oh反应后得到的产物。

28、进一步，所述方法包括以下步骤：以化合物6为底物，加入phe-oh、iodo-tyr(otbu)-oh、gly-oh、dota-(coot-bu)3、asp(otbu)-oh和荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物6为euk与ahx-oh、lys(dde)-oh反应后得到的产物。

29、进一步，所述方法包括以下步骤：以化合物7为底物，加入lys(dde)-oh、phe-oh、3-iodo-tyr(otbu)-oh、gly-oh、dota-(coot-bu)3、asp(otbu)-oh和荧光基团反应后，得到式（ⅳ）所示荧光探针，通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针，所述化合物7为euk与ahx-oh反应后得到的产物。

30、进一步，所述方法包括以下步骤：以树脂resin-euk为底物，将物料fmoc-ahx-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-3-iodo-tyr(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、dota-(coot-bu)3、fmoc-asp(otbu)-oh依次使用标准fmoc化学法合成肽树脂；将肽树脂除去fmoc保护基，加入荧光基团反应合成荧光肽树脂；将荧光肽树脂用裂解混合物处理后，得到式（ⅳ）所示荧光探针；通过锗-镓发生器以68ga标记荧光探针，得到所述核素/荧光双模态探针。

31、进一步，所述euk为谷氨酸-脲-赖氨酸。

32、进一步，所述荧光基团如式（ⅲ）所示。

33、进一步，以树脂resin-euk的用量计，fmoc-ahx-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-3-iodo-tyr(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、dota-(coot-bu)3、fmoc-asp(otbu)-oh和荧光基团的用量为4/3摩尔当量。

34、进一步，所述裂解混合物，按重量百分比计，包括90%三氟乙酸、5%三异丙基硅烷、5% h2o。

35、本发明第四方面提供了一种检测组合物，所述检测组合物包含本发明第一方面所述的荧光探针和/或本发明第二方面所述的核素/荧光双模态探针。

36、进一步，所述检测组合物还包括其它可用于检测psma的探针或抗体。

37、在本发明中，对所述其它可用于检测psma的探针或抗体不设限制，任何可用于检测psma的探针或抗体均将落入本发明的保护范围内。

38、本发明第五方面提供了一种用于检测样本中psma水平的试剂，所述试剂包含本发明第一方面所述的荧光探针、本发明第二方面所述的核素/荧光双模态探针或本发明第四方面所述的检测组合物以及辅助试剂。

39、进一步，所述辅助试剂包括水、生理盐水、缓冲液或乙醇中的任意一种或多种。

40、在一些实施方案中，所述缓冲液是指由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定。常见的缓冲体系有：弱酸和它的盐（如hac---naac）；弱碱和它的盐（nh3·h2o---nh4cl）；多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐（如nah2po4---na2hpo4）的水溶液组成。常见的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（pbs）、tris缓冲液、hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液等。

41、本发明第六方面提供了一种用于检测样本中psma水平的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的荧光探针、本发明第二方面所述的核素/荧光双模态探针、本发明第四方面所述的检测组合物或本发明第五方面所述的试剂。

42、在一些实施方案中，所述试剂盒的组件可以在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器工具通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器工具，组分可以放置在其中，并且优选适当地等分。在试剂盒中有多于一个组分的情况下，所述试剂盒通常还包含第二个、第三个或其它附加的容器，附加的组件可以单独放置在其中。然而，小瓶中可以包含组分的各种组合。所述试剂盒还可以包含用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其它稀释剂的工具。任选地，提供介绍这样的试剂盒的使用指导的说明书。

43、本发明第七方面提供了如下任一种应用：

44、1）本发明第一方面所述的荧光探针或本发明第二方面所述的核素/荧光双模态探针在制备用于检测样本中psma水平的试剂或试剂盒中的应用。

45、2）本发明第一方面所述的荧光探针或本发明第二方面所述的核素/荧光双模态探针在制备用于手术中荧光成像的产品中的应用。

46、3）本发明第一方面所述的荧光探针、本发明第二方面所述的核素/荧光双模态探针、本发明第四方面所述的检测组合物、本发明第五方面所述的试剂或本发明第七方面所述的试剂盒在制备用于诊断前列腺癌的产品中的应用。

47、进一步，所述手术为根治性前列腺癌切除术。

48、在一些实施方案中，所述样本包括但不限于：组织、血液、细胞、淋巴液、滑膜液、外泌体、细胞提取物、粪便、尿液、唾液、痰液、关节腔液、胸腹水、浆膜腔积液、淋巴液、脑脊液、宫腔液、消化液、胆汁、肺泡支气管清洗液、脏器及其任意组合。

49、本发明的优点和有益效果：

50、本发明利用非特异性荧光探针ir820类似物在psma配体glu-urea-lys结构的基础上开发了一种核素-荧光双模态靶探针[68ga]-psma-df。所述探针兼具有放射性和荧光模态，利用放射性的强穿透能力实现肿瘤早期诊断和初步定位，而后切换荧光模态进行术中导航，实现肿瘤实时可视化。本发明探针具有高敏感性、良好的肿瘤靶向特异性和安全性，是一种有前途的双模态示踪剂，具有临床前列腺癌pet/ct成像和术中光学实时成像的潜力。