一种ABL1-SH2高亲和力蛋白配体及其应用

本发明属于生物工程，具体地，本发明公开了一种abl1-sh2高亲和力蛋白配体xua，所述蛋白适用于针对abl激酶的药物制备。

背景技术：

1、abl1是一种非受体型酪氨酸激酶，在细胞质和细胞核中均有分布，广泛参与了一系列生理过程，具有多种生物学功能，如细胞黏附、迁移、dna损伤修复以及细胞周期调控等，其异常活化与多种人类疾病密切相关，特别是慢性粒细胞白血病(cml)。关于abl1激酶对于肿瘤的作用，尽管没有染色体易位现象，但其表达增高、激活剂及下游作用底物的相互作用调节等因素，使其成为肿瘤发生发展的重要参与者。abl1激酶的src同源结构域2(sh2)是细胞信号传导中的关键元件，能够特异性识别并结合磷酸化酪氨酸残基，调控多种细胞过程，促进abl激酶更好发挥其作用。然而，目前针对abl1-sh2的高亲和力蛋白配体的研究相对有限，限制了其在疾病治疗中的应用潜力。已有的配体蛋白亲和力有待提高，限制了在一般条件下靶向sh2结构域治疗疾病的应用。

2、fn3支架类抗体是基于人源ⅲ型第十纤连蛋白结构域的类抗体，只有10kda，分子量小，渗透性好，结构稳定。由高度稳定的β折叠区和三个环状可变区构成。类抗体支架蛋白的应用前景广阔，既可以在基础研究中发挥重大作用，又能应用于临床诊断与治疗。与传统的抗体药物相比，类抗体具有低成本、胞内高稳定性、弱免疫效应以及口服易吸收等优势，已成为药物研发的热点领域之一。ha4蛋白是通过噬菌体展示技术发现的一个fn3支架蛋白，它可以与人abl1蛋白的sh2亚基特异性结合。研究证明，在细胞内的ha4蛋白通过与abl1-sh2结合从而抑制abl1的磷酸化过程，并抑制stat5的活性，抑制酪氨酸激酶的组成性激活。这表明ha4抗体有可能成为抗癌候选药物，或用于bcr abl1导致的癌症的机理的研究等。

3、因此，本领域亟需开发具有更高亲和力的abl1-sh2蛋白的类ha4配体。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高亲和力的abl1-sh2蛋白配体xua蛋白及其应用。

2、本发明的第一方面，提供了一种abl1-sh2蛋白配体，包括：

3、(i)如seq id no:2所示的氨基酸序列；和

4、(ii)任选的标签序列。

5、在另一优选例中，所述标签序列包括：6×his标签、小泛素样修饰蛋白标签。

6、在另一优选例中，所述蛋白配体衍生自ha4蛋白。

7、在另一优选例中，所述蛋白配体为突变的ha4蛋白。

8、在另一优选例中，所述突变的ha4蛋白的氨基酸序列为：如seq id no:4所示的氨基酸序列并且在seq id no:4中有以下突变：s32i、i39v、y41c、g42s、e52d、p56l、s58g、s59n、s60f、a85e、y91h。

9、在另一优选例中，所述蛋白配体具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

10、在另一优选例中，所述蛋白配体与abl1-sh2的亲和力显著提高。

11、在另一优选例中，使用等温滴定量热法测定亲和力。

12、在另一优选例中，所述“显著提高”是指与ha4蛋白与abl1-sh2的亲和力a0相比，所述蛋白配体与abl1-sh2的亲和力a1，满足a1/a0≤0.045％。

13、本发明的第二方面，提供了一种类抗体，包括以下结构：

14、(1)β折叠区，其氨基酸序列如seq id no:2中第1-27、36-56、61-79和93-101位所示；

15、(2)bc环，其氨基酸序列如seq id no:2中第28-35位所示；

16、(3)de环，其氨基酸序列如seq id no:2中第57-60位所示；

17、(4)fg环，其氨基酸序列如seq id no:2中第80-92位所示。

18、本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的重组蛋白或本发明第二方面所述的类抗体；所述多核苷酸选自下组：。

19、(s1)如seq id no:1所示的核苷酸序列；。

20、(s2)与seq id no:1具有≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％中任一序列同一性的核苷酸序列。

21、本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。

22、本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞编码含有本发明第四方面所述的表达载体、基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸、表达本发明第二方面所述的类抗体、或表达本发明第一方面所述的蛋白配体。

23、在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞。

24、在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。

25、本发明的第六方面，提供了一种药物或药物组合物，包含：

26、(z1)本发明第一方面所述的蛋白配体、本发明第二方面所述的类抗体、或本发明第三方面所述的多核苷酸；

27、(z2)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。

28、在另一优选例中，所述药物或药物组合物是靶向药物或药物组合物。

29、在另一优选例中，所述多核苷酸为mrna。

30、在另一优选例中，所述载体包括：病毒载体、脂质体载体、病毒样载体、外泌体载体。

31、在另一优选例中，所述药物或药物组合物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

32、本发明的第七方面，提供了一种药盒，包括：

33、(a)第一容器，以及位于第一容器的本发明第一方面所述的蛋白配体、本发明第二方面所述的类抗体、或本发明第三方面所述的多核苷酸；

34、(b)第二容器，以及位于第二容器的其他治疗疾病的药物。

35、在另一优选例中，所述疾病为癌症。

36、在另一优选例中，所述其他治疗癌症的药物包括：化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、激素治疗药物、放射增敏剂、蛋白酶体抑制剂。

37、在另一优选例中，所述免疫治疗药物包括：pd-1/pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、car-t细胞疗法、新抗原肽疗法。

38、在另一优选例中，所述药盒还包括标签或说明书。

39、本发明的第八方面，提供了一种本发明第一方面所述蛋白配体、本发明第二方面所述类抗体、本发明第三方面所述多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述药物或药物组合物的用途，用于(i)制备治疗/预防癌症的药物，和/或(ii)研究癌症机理。

40、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

1.一种abl1-sh2蛋白配体，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的蛋白配体，其特征在于，所述蛋白配体为突变的ha4蛋白；所述突变的ha4蛋白的氨基酸序列为：如seq id no:4所示的氨基酸序列并且在seq id no:4中有以下突变：s32i、i39v、y41c、g42s、e52d、p56l、s58g、s59n、s60f、a85e、y91h。

3.如权利要求1所述的蛋白配体，其特征在于，所述蛋白配体与abl1-sh2的亲和力显著提高；所述“显著提高”是指与ha4蛋白与abl1-sh2的亲和力a0相比，所述蛋白配体与abl1-sh2的亲和力a1，满足a1/a0≤0.045％。

4.一种类抗体，其特征在于，包括以下结构：

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的重组蛋白或权利要求3所述的类抗体；所述多核苷酸选自下组：

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞编码含有权利要求6所述的表达载体、基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸、表达权利要求4所述的类抗体、或表达权利要求1所述的蛋白配体；所述宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞；所述原核细胞为大肠杆菌。

8.一种药物或药物组合物，其特征在于，包含：

9.一种药盒，其特征在于，包括：

10.一种权利要求1所述蛋白配体、权利要求4所述类抗体、权利要求5所述多核苷酸、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求8所述药物或药物组合物的用途，其特征在于，用于(i)制备治疗/预防癌症的药物，和/或(ii)研究癌症机理。