一种万寿菊浸膏中叶黄素酯的皂化分离方法与流程

本发明涉及类胡萝卜素酯化物皂化转化及选择性分离，更具体地说，本发明涉及一种万寿菊浸膏中叶黄素酯的皂化分离方法。

背景技术：

1、在天然产物有效成分分离提取领域，万寿菊浸膏通常作为叶黄素类原料的重要来源，其后续处理一般通过皂化反应切断叶黄素酯和玉米黄质酯中的脂肪酸酯键，再结合萃取、结晶或吸附纯化获得游离叶黄素类化合物；

2、叶黄素具有被六元非芳环取代的共轭多烯侧链结构，属于化学药品原料药制备过程中具有明确结构特征的天然活性成分，也可进一步用于制剂制造及生物医药产业中的功能原料开发；

3、实际生产中，万寿菊浸膏经皂化后所得混合物通常同时含有叶黄素和玉米黄质，两者均具有较长的共轭多烯骨架、两个端部六元非芳环及两个羟基，分子量、整体极性和溶解行为高度接近，差异主要集中在端部环结构：叶黄素一端为β-环、另一端为ε-环，玉米黄质两端均为β-环；

4、在需要分别获得叶黄素和玉米黄质两种独立产品时，常规溶剂分配、低温析晶及吸附分离只能利用二者有限的整体物性差异，难以稳定读取其端部环结构差别，生产中容易出现两种组分共同析出、相互夹带以及回收率提高后产品纯度下降的现象；即使采用酶促酰化放大两者反应差异，若先形成的酰化产物仍停留在同一反应体系内，随着反应继续进行，后反应组分仍可能逐步完成酰化，使初始选择性被持续削弱，最终无法形成稳定的分离界面；

5、本技术要解决的技术问题是：如何利用叶黄素两端环结构不等价与玉米黄质两端环结构同类的差异，使二者形成不同酰化端数的产物，并使先形成的酰化产物及时脱离反应区域，从而阻止后续反应追平并实现叶黄素与玉米黄质的选择性分离。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种万寿菊浸膏中叶黄素酯的皂化分离方法，通过构建叶黄素与玉米黄质差异化酰化路径，使万寿菊浸膏中的天然类胡萝卜素有效成分经选择性转化形成不同酯化产物，并结合跨膜迁移实现酰化产物空间分离，为化学药品原料药制备过程中的叶黄素分离提供结构选择性处理路径，同时满足后续制剂制造过程中对天然活性成分纯度控制的需求，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种万寿菊浸膏中叶黄素酯的皂化分离方法，包括：

3、s1、将万寿菊浸膏与醇碱液混合，使叶黄素酯和玉米黄质酯分别断开脂肪酸酯键，经中和、分相、水洗和脱水，获得含游离叶黄素和游离玉米黄质的类胡萝卜素混合料；

4、s2、将类胡萝卜素混合料分成多个酶筛选份，向各酶筛选份分别加入一种食品工业用脂肪酶或酯酶及同一种酰基供体，反应后分别测定叶黄素单酯、叶黄素二酯、玉米黄质单酯和玉米黄质二酯的色谱峰面积；按叶黄素单酯在叶黄素酰化产物中的峰面积占比由前至后排列各脂肪酶或酯酶，并按玉米黄质二酯在玉米黄质酰化产物中的峰面积占比由前至后排列各脂肪酶或酯酶，将两个排列中序位之和位于首位的脂肪酶或酯酶确定为分叉酰化酶；

5、s3、将类胡萝卜素混合料、分叉酰化酶和酰基供体加入酰化反应液，使叶黄素的一个端部羟基接受一次酰化并形成叶黄素单酯，使玉米黄质的两个β-环端羟基依次接受酰化并形成玉米黄质二酯；

6、s4、在酰化反应期间，使酰化反应液沿多孔隔离层的一侧循环，使单酯接收液沿多孔隔离层的另一侧循环；叶黄素单酯生成后穿过多孔隔离层进入单酯接收液，并随单酯接收液离开酰化反应区域；游离玉米黄质和玉米黄质单酯留在酰化反应液中继续接受酰化，直至形成玉米黄质二酯；

7、其中，所述多孔隔离层由聚四氟乙烯膜、聚偏氟乙烯膜或聚丙烯膜中的一种制成，并选取孔径范围为0.05～1μm的疏水多孔膜形成液液传质界面，使叶黄素单酯基于酰化反应液与单酯接收液之间的分配差异进入单酯接收液，并使分叉酰化酶限制于酰化反应液侧；

8、s5、分别从单酯接收液中分离叶黄素单酯，从酰化反应液中分离玉米黄质二酯；使叶黄素单酯断开一个酯键并恢复为游离叶黄素，使玉米黄质二酯依次断开两个酯键并恢复为游离玉米黄质，分别获得叶黄素产品和玉米黄质产品。

9、在一个优选的实施方式中，所述s1包括：

10、将万寿菊浸膏加入乙醇并搅拌分散，加入氢氧化钾乙醇液，使万寿菊浸膏中的叶黄素二酯依次转化为叶黄素单酯和游离叶黄素，使玉米黄质酯转化为游离玉米黄质；

11、向皂化液中加入柠檬酸水溶液，直至皂化液中的剩余氢氧化钾完成中和，加入正庚烷萃取游离叶黄素和游离玉米黄质，分离含脂肪酸盐的水醇相；

12、使用水洗涤正庚烷相，脱除正庚烷相中的水和正庚烷，获得类胡萝卜素混合料。

13、在一个优选的实施方式中，所述s2中的酶筛选份按照相同质量的类胡萝卜素混合料、相同摩尔量的酰基供体、相同质量的脂肪酶或酯酶及相同反应时长设置；

14、每个酶筛选份反应结束后，采用液相色谱分别获得叶黄素单酯峰面积、叶黄素二酯峰面积、玉米黄质单酯峰面积和玉米黄质二酯峰面积；

15、叶黄素单酯在叶黄素转化产物中的峰面积占比，由叶黄素单酯峰面积除以游离叶黄素峰面积、叶黄素单酯峰面积和叶黄素二酯峰面积之和获得；玉米黄质二酯在玉米黄质转化产物中的峰面积占比，由玉米黄质二酯峰面积除以游离玉米黄质峰面积、玉米黄质单酯峰面积和玉米黄质二酯峰面积之和获得。

16、在一个优选的实施方式中，分叉酰化酶确定后，将游离叶黄素、游离玉米黄质以及游离叶黄素与游离玉米黄质的等摩尔混合物分别作为复核底物，与分叉酰化酶和同一种酰基供体反应；

17、分别记录三种复核底物反应过程中叶黄素单酯、叶黄素二酯、玉米黄质单酯和玉米黄质二酯随取样次序形成的峰面积序列；

18、在等摩尔混合物对应的峰面积序列中，叶黄素单酯峰先于叶黄素二酯峰形成连续增加段，且玉米黄质二酯峰在玉米黄质单酯峰形成连续增加段后继续增加时，将分叉酰化酶用于s3。

19、在一个优选的实施方式中，酰基供体从乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯和月桂酸乙烯酯中选取；

20、将各酰基供体分别与分叉酰化酶及等摩尔的游离叶黄素和游离玉米黄质反应，测定各酰基供体对应的叶黄素单酯峰面积、叶黄素二酯峰面积、玉米黄质单酯峰面积和玉米黄质二酯峰面积；

21、分别计算各酰基供体对应的叶黄素单酯峰面积占比和玉米黄质二酯峰面积占比，并按照两个峰面积占比的序位之和进行排列，将序位之和位于首位的酰基供体确定为酰化反应所采用的酰基供体。

22、在一个优选的实施方式中，s4所采用的酰化反应液和单酯接收液包括通过以下方式确定：

23、分别使用正庚烷、异辛烷或环己烷配制含游离叶黄素、叶黄素单酯、游离玉米黄质、玉米黄质单酯和玉米黄质二酯的测试反应液，分别使用乙醇水溶液、丙二醇水溶液或乙醇与丙二醇的混合水溶液作为测试接收液；

24、使测试反应液和测试接收液分置于多孔隔离层两侧并循环接触，分别测定接触前后测试反应液和测试接收液中的叶黄素单酯及玉米黄质二酯含量；

25、按叶黄素单酯从测试反应液转入测试接收液的转移比例由前至后排列各液相组合，并按玉米黄质二酯留在测试反应液中的保留比例由前至后排列各液相组合，将两个排列中序位之和位于首位的液相组合作为酰化反应液和单酯接收液。

26、在一个优选的实施方式中，多孔隔离层由疏水多孔膜构成，分叉酰化酶固定于疏水多孔膜朝向酰化反应液的一侧；

27、酰化反应液沿疏水多孔膜的膜面流动，单酯接收液沿疏水多孔膜的另一膜面反向流动，叶黄素单酯形成后由酰化反应液进入疏水多孔膜的孔道，再由孔道进入单酯接收液；

28、分叉酰化酶保留在酰化反应液一侧，叶黄素单酯进入单酯接收液后不再与分叉酰化酶接触，使叶黄素单酯停止第二端酰化。

29、在一个优选的实施方式中，单酯接收液离开疏水多孔膜后进入叶黄素单酯分离段，脱除单酯接收液中的部分乙醇，使叶黄素单酯析出并经固液分离取得；

30、分离叶黄素单酯后的单酯接收液补入与脱除量相同的乙醇后返回疏水多孔膜；

31、由此使进入单酯接收液的叶黄素单酯持续离开疏水多孔膜两侧的相界接触区域，并维持单酯接收液对后续生成叶黄素单酯的接收。

32、在一个优选的实施方式中，在酰化反应期间按相同时间间隔分别采集酰化反应液和单酯接收液，测定叶黄素单酯、叶黄素二酯、游离玉米黄质、玉米黄质单酯和玉米黄质二酯的色谱峰面积；

33、当酰化反应液中的叶黄素单酯峰面积连续下降、单酯接收液中的叶黄素单酯峰面积连续增加且酰化反应液中的玉米黄质二酯峰面积连续增加时，继续循环两种液相；

34、当单酯接收液中的叶黄素单酯峰面积不再增加且酰化反应液中的玉米黄质二酯峰面积不再增加时，停止加入酰基供体并分离酰化反应液和单酯接收液。

35、在一个优选的实施方式中，将从单酯接收液中取得的叶黄素单酯与固定化酯酶接触，使叶黄素单酯断开一个酯键，分离固定化酯酶、脂肪酸和溶剂，获得游离叶黄素；

36、将从酰化反应液中取得的玉米黄质二酯与固定化酯酶接触，使玉米黄质二酯依次断开两个酯键，分离固定化酯酶、脂肪酸和溶剂，获得游离玉米黄质；

37、将叶黄素脱酰母液中检出的玉米黄质酯返回s3，将玉米黄质脱酰母液中检出的叶黄素酯返回s4，使未进入对应产品的类胡萝卜素重新进入酰化分叉和跨相分离过程。

38、本发明的技术效果和优点：

39、1、通过分叉酰化酶使叶黄素和玉米黄质按照端部环结构差异分别形成叶黄素单酯和玉米黄质二酯，并利用疏水多孔膜将叶黄素单酯及时移出酰化反应区域，减少叶黄素单酯继续发生二次酰化，使叶黄素与玉米黄质形成持续分离基础，缓解两者因反应体系内持续转化导致的分离选择性降低问题；

40、2、通过对脂肪酶或酯酶的双指标筛选，依据叶黄素单酯形成比例和玉米黄质二酯形成比例确定分叉酰化酶，使酶促反应过程具备叶黄素单酯形成和玉米黄质二酯形成的差异化反应路径；

41、3、通过对酰基供体进行筛选，使所选酰基供体与分叉酰化酶共同作用时保持叶黄素单酯形成和玉米黄质二酯形成的反应方向，改善酰化产物结构差异；

42、4、通过疏水多孔膜两侧液相循环，使叶黄素单酯进入单酯接收液，并使玉米黄质二酯保留于酰化反应液，形成两类酯化产物的空间分离；

43、5、通过分别对叶黄素单酯和玉米黄质二酯进行固定化酯酶脱酰，使两类酯化产物恢复为游离叶黄素和游离玉米黄质，利于获得对应天然产物有效成分。