一种高活性高稳定性脂肪酶突变体及其应用

本发明涉及一种高活性高稳定性脂肪酶突变体及其应用，属于酶工程和酶固定化。

背景技术：

1、脂肪酶是一类能够催化甘油酯类化合物水解、酯化及酯交换反应的生物催化剂，广泛存在于微生物、动物和植物中。由于脂肪酶具有反应条件温和、底物适应范围较广、选择性较好以及适用于油水界面反应等特点，其已被应用于食品加工、油脂改性、洗涤剂、生物柴油制备、医药中间体合成和环境污染物降解等领域。在油脂加工等应用场景中，脂肪酶的催化活性直接影响反应速率、底物转化率和产物生成效率，是评价其工业应用价值的重要指标之一。目前，为改善脂肪酶的催化性能，行业内通常采用天然酶筛选、定向进化、理性设计、半理性设计及定点突变等方式对脂肪酶进行改造。上述方法能够在一定程度上提高脂肪酶的酶活、底物适应性或耐受性能。然而，工业反应体系通常伴随较高温度、复杂酸碱环境、有机溶剂、高底物浓度及长时间运行等条件，容易影响酶蛋白的空间构象和活性中心状态，导致酶活下降甚至失活。部分改造策略虽然能够提高初始催化活性，但可能降低蛋白结构稳定性；部分提高稳定性的改造又可能限制活性中心构象变化或底物进入通道，从而造成催化效率下降。因此，现有脂肪酶改造技术仍存在酶活和稳定性难以同步提升的问题，限制了其在连续化、规模化油脂加工过程中的应用。

2、除对酶分子本身进行改造外，酶固定化也是提高脂肪酶应用性能的重要技术方向。现有固定化方法主要包括物理吸附、包埋、交联和化学偶联等，通过将酶固定于载体或特定界面上，可改善酶的重复使用性、便于产物分离，并有助于提高反应体系的操作稳定性。但传统固定化方法仍存在固载效率有限、酶分子取向随机、活性位点可能被遮挡、底物传质受限以及固定化后酶活损失等问题，导致固定化脂肪酶的实际催化效果和应用稳定性仍难以满足部分工业反应需求。近年来，利用材料结合肽或锚定肽增强目标蛋白与特定材料表面的结合，已成为酶定向固定化研究中的一种新思路。该类短肽可作为酶蛋白与载体之间的结合模块，提高酶在材料表面的富集能力和固载效率，并有助于改善固定化体系的稳定性。然而，材料结合肽与脂肪酶融合后，其融合位置、连接方式和空间间隔会影响脂肪酶的正确折叠、活性中心暴露以及底物接近活性位点的效率。若连接设计不合理，可能出现固载效率提高但酶活降低，或固定化稳定性改善但催化效率不足等问题。因此，现有材料结合肽介导的固定化技术仍需要进一步优化酶与短肽之间的连接方式，以兼顾蛋白表达、酶活保持、固载效率和固定化应用性能。

3、综上，现有技术中仍缺乏一种能够同时提高脂肪酶催化活性、稳定性和固定化应用效果的综合改造方案。如何通过脂肪酶分子再设计提高酶活和稳定性，并进一步结合材料结合肽及连接方式优化提高固载效率和固定化催化效果，是脂肪酶工程化改造和工业化应用中亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的脂肪酶酶活性不高、催化稳定性较差以及固载效率和固定化应用效果受限的问题，本发明提供一种脂肪酶活性中心远端氨基酸突变体改造的方法，构建了稳定性和催化活性协同提升的方法，融合材料结合肽在大肠杆菌中异源表达，通过固定化应用可以水解橄榄油的效率达到91.7%。通过该方法得到的脂肪酶，可以放大制备，且酶活和催化稳定性均得到了显著的提升。

2、本发明提供的第一个技术方案是一种脂肪酶突变体，相对于亲本，具有如下多个位点的突变：a11q、a80i、v89i、s98a、y134k、s141e、n159h、t171a、q176g、y180f、n183k、a191p、l226d、t236v、l239f、a245f、f254y、s265a、q267p、s286d、n305f和l322n。

3、在一种实施方式中，所述突变是在氨基酸序列如seq id no.1示的基础上，具有如下突变：

4、将第11位丙氨酸突变为谷氨酰胺；将第80位丙氨酸突变为异亮氨酸；将第89位缬氨酸突变为异亮氨酸；将第98位丝氨酸突变为丙氨酸；将第134位酪氨酸突变为赖氨酸；将第141位丝氨酸突变为谷氨酸；将第159位天冬酰胺突变为组氨酸；将第171位苏氨酸突变为丙氨酸；将第176位谷氨酰胺突变为甘氨酸；将第180位酪氨酸突变为苯丙氨酸；将第183位天冬酰胺突变为赖氨酸；将第191位丙氨酸突变为脯氨酸；将第226位亮氨酸突变为天冬氨酸；将第236位苏氨酸突变为缬氨酸；将第239位亮氨酸突变为苯丙氨酸；将第245位丙氨酸突变为苯丙氨酸；将第254位苯丙氨酸突变为酪氨酸；将第265位丝氨酸突变为丙氨酸；将第267位谷氨酰胺突变为脯氨酸；将第286位丝氨酸突变为天冬氨酸；将第305位天冬酰胺突变为苯丙氨酸；将第322位亮氨酸突变为天冬酰胺。

5、本发明提供的第二个技术方案为一种融合蛋白，所述融合蛋白为第一个技术方案所述的脂肪酶突变体连接有材料结合锚定肽。

6、在一种实施方式中，所述材料结合锚定肽包括组蛋白短肽（macaque histatin）、蛋氨酸短肽（metrich）、抗菌肽前体（hdermcidin）、结合塑料抗菌肽（lci）。

7、在一种实施方式中，所述组蛋白短肽、蛋氨酸短肽、抗菌肽前体、结合塑料抗菌肽的氨基酸序列分别如seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11所示。

8、在一种实施方式中，所述融合蛋白为第一个技术方案所述的脂肪酶突变体使用聚酰亚胺离子短肽、柔性连接子或刚性连接子连接所述材料结合锚定肽。

9、在一种实施方式中，聚酰亚胺离子短肽、柔性连接子、刚性连接子的氨基酸序列分别如seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14所示。

10、本发明提供的第三个技术方案为编码第一个技术方案所述脂肪酶突变体或第二个技术方案所述融合蛋白的基因。

11、本发明提供的第四个技术方案为携带有第三个技术方案所述基因的重组载体。

12、本发明提供第五个技术方案为表达第一个技术方案所述脂肪酶突变体或第二个技术方案所述融合蛋白，或含有第三个技术方案所述基因，或转化有第四个技术方案所述重组载体的重组微生物。

13、在一种实施方式中，所述重组微生物包括但不限于大肠杆菌。

14、在一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，以pet-28a为表达载体，表达第一个技术方案所述的脂肪酶突变体或者第二个技术方案所述的融合蛋白。

15、本发明提供的第六个技术方案为一种固定化酶，所述固定化酶为第二个技术方案所述的融合蛋白通过吸附作用与材料dmons相结合制备获得。

16、本发明还提供了制备固定化酶的方法，将重组大肠杆菌发酵生产的第二个技术方案所述的融合蛋白以20 ml粗酶液与0.2 g的dmons反应，通过超声与抽真空的方式使酶与材料的均匀分布在溶剂中。

17、本发明提供的第七个技术方案为一种水解油脂的方法，所述方法为利用第一个技术方案所述的突变体、第二个技术方案所述的融合蛋白或第六个技术方案所述的固定化酶对油脂进行水解。

18、在一种实施方式中，所述油脂包括但不限于菜籽油或橄榄油中的一种或多种，所述水解包括水解为甘油二酯或完全水解。

19、在一种实施方式中，所述方法是将所述脂肪酶突变体以≥10148.8 ± 4475.1 u/mg浓度添加在菜籽油中，在60~65℃反应0.5~1 h。

20、在一种实施方式中，所述方法是将第六个技术方案所述的固定化酶以60.9~68.7mg/g的浓度添加在橄榄油中，在50~55℃反应12 h。

21、本发明提供的第八个技术方案为第一个技术方案所述的脂肪酶突变体、第二个技术方案所述的融合蛋白、第三个技术方案所述的基因、第四个技术方案所述重组载体、第五个技术方案所述的重组微生物或第六个技术方案所述的固定化酶在油脂加工领域的应用。

22、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

23、（1）本发明将脂肪酶突变体t23s进行再设计，采用保留活性位点与结合位点，并对底物活性口袋远端氨基酸进行突变的策略，成功筛选出突变体p7。该突变体的比酶活达到10148.8 ± 4475.1 u/mg，相较于改造前的比酶活（77.78 u/mg）提升了134.5倍，较现有技术（公开号为cn120866274a的专利申请）中的脂肪酶突变体的最适催化温度提升了20℃、半衰期提高了33.3倍，兼具优异的催化性能和稳定性。

24、（2）本发明还将突变体p7应用于水解菜籽油，在60℃条件下，按照油：水：pbs比在4：3：3的条件下，仅需0.5~1 h时间即可制备42.7%~44.1%的甘油二酯，符合国家gb/t46928-2025新食品原料要求（甘油二酯含量≥40%）。

25、（3）本发明还发明了一种固定化酶构建及应用的方法，构建材料结合锚定肽文库，同时，设计了不同的聚丙氨酸离子短肽、聚酰亚胺离子短肽、刚性和柔性连接子连接方式，能够快速提高脂肪酶突变体的固载效率，显著提升固定化酶完全水解底物应用，在60℃反应12小时，橄榄油的水解效率达到了91.7%，显示出良好的工业应用前景。