一种用于检测LSDV的SYBRGreenI荧光定量PCR检测引物及应用

本发明属于病毒检测，尤其涉及一种用于检测lsdv的sybr green i荧光定量pcr检测引物及应用。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，lsd）是由牛结节性皮肤病病毒（lumpyskin disease virus，lsdv）引起的一种急性接触性传染病。牛感染后，临床上多表现为持续高热（40~41 ℃），消瘦、眼鼻口分泌物增多，患病动物的皮肤、黏膜和内脏器官上出现广泛性结节，淋巴结肿大等。

2、有研究报道lsd发病率为5%~45%，死亡率为10%。虽然大部分患病牛可恢复为亚健康状态，但仍伴有乳房炎、肺炎和皮肤结节等发生。该病严重影响养牛业的发展和国际贸易，给养牛业带来巨大经济损失。目前lsd被世界动物卫生组织（oie）列为必须报告的牛疫病之一。

3、lsdv属于痘病毒科（

poxviridae）、脊索痘病毒亚科（

chordopoxvirinae，chpv）、山羊痘病毒属（

capripoxvirus，capv）的一员，与山羊痘病毒（

goatpox virus，gtpv）和绵羊痘病毒（

sheeppox virus, sppv）同属。羊痘病毒属的这三种病毒存在交叉保护性，且基于血清学试验无法对三者进行区分。

4、而临床中多用羊痘疫苗对牛进行免疫，因此建立一种能够与gtpv区分的高灵敏性、特异强、重复性好的lsdv特异性荧光定量pcr检测方法对自然感染的lsdv或免疫后带毒的牛进行区分尤为重要。

技术实现思路

1、由此，为建立能够与gtpv、sppv区分的lsdv特异性荧光定量pcr检测方法，本发明基于genbank中已经公布的gtpv、sppv、lsdv全基因组序列（检索日期：2024年5月30日，lsdv116条，sppv 22条，gtpv 10条），经全基因组比对后设计一对特异性扩增引物，成功建立能够特异性检测lsdv的荧光定量pcr检测方法，为临床中区分山羊痘病毒属感染及感染监测提供技术保障。

2、本发明提供了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的sybr green i荧光定量pcr引物对，所述引物对包括：

3、上游引物 lsdv-f，其核苷酸序列如seq id no.1所示；

4、下游引物 lsdv-r，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明提供了一种检测试剂，所述试剂包含引物对。

6、进一步地，所述试剂还包括sybr green i荧光定量pcr反应预混液、阳性对照品和阴性对照品。

7、本发明提供了一种非诊断目的的利用引物对检测牛结节性皮肤病病毒的方法，包括以下步骤：

8、（1）提取待测样品dna；

9、（2）以提取的dna为模板，使用引物对进行sybr green i荧光定量pcr扩增；

10、（3）分析扩增曲线和溶解曲线，判断检测结果。

11、进一步地，步骤（2）所述sybr green i荧光定量pcr的反应体系为：

12、2 × chamq universal sybr qpcr master mix 10 μl；

13、10 µm的上游引物 lsdv-f 0.8 μl；

14、10 µm的下游引物 lsdv-r 0.6 μl；

15、dna模板 1 μl；

16、以及ddh2o补足至20 μl。

17、进一步地，步骤（2）所述sybr green i荧光定量pcr的扩增程序为：

18、95℃预变性30 s；

19、95℃变性10 s，42~50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；

20、随后进行溶解曲线分析。

21、进一步地，所述溶解曲线的判定标准为：

22、当溶解曲线的温度为74.5±0.5时，即可判定为lsdv特异性扩增；若溶解曲线的温度不是74.5±0.5，则判定为引物的非特异性扩增。

23、进一步地，所述引物对用于区分牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒。

24、本发明提供了一种引物对或试剂在制备牛结节性皮肤病病毒检测产品中的应用。

25、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

26、本发明通过分析genbank数据库已经公开的lsdv、gtpv、sppv的全基因组序列保守区进行分析，设计特异性引物，建立基于sybr green i的qpcr检测方法，经体系优化，该方法的最优扩增体系为2 × chamq universal sybr qpcr master mix 10 μl，primer 1(10 µm) 0.8 μl，primer 2 (10 µm) 0.6 μl，template dna 1 μl，dh2o 7.6 μl，扩增程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，49.5 30s，72℃ 30s，共40个循环，以机器默认程序分析溶解曲线，其溶解温度为74.5 ± 0.5 ℃，具有较好的扩增效率（e=96.5%），检测下限为102copies/μl，重复性较好，能与gtpv进行区分，对同一份核酸检进行倍比稀释后检测发现，其检测灵敏性高于国标检测引物10倍。综上所述，该检测方法能够为lsdv临床检测提供技术保障。

1.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的sybr green i荧光定量pcr引物对，其特征在于，所述引物对包括：

2.一种检测试剂，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括sybr green i荧光定量pcr反应预混液、阳性对照品和阴性对照品。

4.一种非诊断目的的利用权利要求1所述的引物对检测牛结节性皮肤病病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述sybr green i荧光定量pcr的反应体系为：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述sybr green i荧光定量pcr的扩增程序为：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶解曲线的判定标准为：

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物对用于区分牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒。

9.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂在制备牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒中的应用。