一种用于实验小鼠多种病原体检测的引物组合物，试剂盒及其用途

本发明属于病原体分子检测，具体涉及一种用于实验小鼠多种病原体检测的引物组合物，试剂盒及其用途。

背景技术：

1、实验小鼠是生物医学研究中最常用的模式动物之一，其健康状况直接影响科学实验结果的可靠性、可重复性和动物福利。实验小鼠可能感染多种病原体，包括病毒、细菌、寄生虫等，这些感染通常是隐性的，但会引起免疫状态、生理生化指标等方面的改变，导致实验数据出现背景干扰甚至严重偏差。因此，对实验小鼠进行定期的、全面的病原体监测是保障实验动物质量和研究结果科学性、稳定性的重要环节。

2、传统的病原体检测方法主要包括血清学检测、病原分离培养、组织病理学检查等。这些方法通常操作繁琐、耗时长、灵敏度有限，且难以实现高通量、多靶标的同步检测。随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应技术，特别是实时荧光定量pcr技术，因其高灵敏度、高特异性、快速和可定量等优点，已成为病原体检测的金标准。然而，常规的单重实时荧光定量pcr一次只能检测一种病原体，对于需要筛查数十种病原体的情况，不仅试剂消耗大、成本高，而且需要大量的样本和人力，效率低下。

3、多重pcr技术可在同一反应管内同时扩增多个靶标，显著提高了检测通量和效率。目前已有一些针对少量（通常3-5种）实验动物病原体的多重pcr检测方法报道。然而，开发能够单管检测十余种甚至更多病原体的高通量多重实时荧光定量pcr方法面临巨大挑战，主要瓶颈在于：1）多重引物和探针之间可能发生交叉反应或形成二聚体，干扰扩增效率；2）不同靶标扩增效率存在差异，可能导致灵敏度不均一；3）荧光通道数量有限，需要在有限的通道内合理分配众多靶标，并对引物探针进行精细的优化设计。

4、因此，亟需开发一种能够覆盖实验小鼠主要病原体、通量高、灵敏度好、特异性强的单管多重实时荧光定量pcr检测方法，以满足实验动物质量监控和生物安全评估的迫切需求。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于单管检测实验小鼠多种病原体的引物探针组合、检测试剂盒及检测方法，为基因检测服务提供新技术，促进生物医药产业发展。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于实验小鼠多种病原体检测的引物探针组合物，所述病原体为小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒iii型、小鼠肝炎病毒、仙台病毒、小鼠细小病毒、小鼠诺如病毒、嗜肺巴斯德杆菌、牛棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门菌、绿脓杆菌、鼠棒状杆菌、泰泽病原体、支原体、弓形虫、鞭毛虫、纤毛虫、全部蠕虫中的一种或多种，所述引物和所述探针的序列如表1所示。

3、优选地，所述探针标记有荧光基团，具体如下：用于检测小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒iii型、小鼠肝炎病毒、仙台病毒、小鼠细小病毒、小鼠诺如病毒的探针标记有joe荧光基团；用于检测嗜肺巴斯德杆菌、牛棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门菌、绿脓杆菌、鼠棒状杆菌、泰泽病原体、支原体的探针标记有fam荧光基团；用于检测弓形虫、鞭毛虫、纤毛虫、全部蠕虫的探针标记有rox荧光基团。

4、优选地，所述探针均为荧光标记探针，joe通道探针5'端标记joe荧光基团，3'端标记淬灭基团；fam通道探针5'端标记fam荧光基团，3'端标记淬灭基团；rox通道探针5'端标记rox荧光基团，3'端标记淬灭基团。

5、本发明的第二个目的是提供上述的引物探针组合在制备用于检测实验小鼠病原体的试剂盒中的应用。

6、本发明的第三个目的是提供一种用于检测实验小鼠病原体的试剂盒，其包括上述的引物探针组合。

7、优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的试剂，所述内参基因选自actb、gapdh、aldoa、pgk1中的一种或几种。

8、优选地，所述内参基因为actb，所述检测内参基因的试剂包括检测内参基因actb的内参引物或/和内参探针。

9、优选地，所述actb的内参引物为cttctacatgcattgtgatggactc和ttcacttcacaggatggcgtga，所述内参探针为tcacccacactgtgcccatctacgag，所述内参探针5'端标记cy5荧光基团，3'端标记淬灭基团。

10、优选地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、质控试剂、pcr反应试剂中的至少一种。其中，所述pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dntp、mgcl2和taqdna聚合酶。

11、优选地，所述检测试剂盒还包括2×实时荧光定量pcr预混液、无核酸酶水、阳性对照品和阴性对照品。所述阳性对照品为含有上述19种检测目标特异性片段的混合质粒或混合基因组dna。

12、优选地，所述检测试剂盒的实时荧光定量pcr反应体系为25μl，包括：2×实时荧光定量pcr预混液12.5μl，上述的19组引物探针混合物1-5μl，dna模板2-5μl，用无核酸酶水补足至25μl。

13、本发明的第四个目的是提供一种非疾病诊断目的检测实验小鼠样本中多种病原体的方法，其包括以下步骤：a、提取样本总核酸；b、以步骤a提取的核酸为模板，配制包含上述引物探针组合的实时荧光定量pcr反应体系；c、将步骤b的反应体系置于实时荧光定量pcr仪中进行扩增反应；d、反应结束后，根据各荧光通道的ct值判定样本中相应病原体的存在与否。

14、所述样本为粪便、组织或口腔拭子等。

15、优选地，步骤c中实时荧光定量pcr扩增的反应程序为：逆转录：50-55℃，3-15min；预变性：95℃，1-5min；循环反应：94-95℃ 5-15s，55-60℃ 10-45s，共40-45个循环；在循环反应的退火延伸步骤采集各通道的荧光信号；步骤d中所述的病原体的存在与否的判定方法为：以小鼠actb基因的标记荧光基团cy5通道的ct值小于35作为核酸提取及pcr反应有效的内控标准；针对各病原体检测通道，若ct值小于或等于38，且有明显的扩增曲线，则判定为该病原体阳性；若ct值大于38或无ct值，则判定为该病原体阴性。

16、本发明提供了一种非疾病诊断目的的实验小鼠多种病原体的单管多重实时荧光定量pcr检测方法，采用上述的引物探针组合或检测试剂盒进行检测，所述引物探针组合包括19组特异性引物对及对应的taqman探针，其序列如表1所示。其中，用于检测病毒的探针标记有joe荧光基团；用于检测细菌的探针标记有fam荧光基团；用于检测寄生虫的探针标记有rox荧光基团；用于检测小鼠内参基因的探针标记有cy5荧光基团。这种按病原体类别分配荧光通道的设计，便于结果的判读和分析。

17、本发明的有益效果在于：

18、高通量、高效率：本发明首次实现了在一个反应管中同时检测18种实验小鼠关键病原体和1个内参基因，将传统需要数十个反应才能完成的筛查工作压缩至一个反应，极大提高了检测效率，降低了试剂成本和人力成本。本发明的技术方案能够在单个实时荧光定量pcr反应管内，同时检测18种实验小鼠常见病原体（6种病毒、7种细菌和1支原体、4种寄生虫）和1个小鼠内参基因，实现了对实验小鼠微生物状态的一站式、高通量筛查。

19、高特异性与灵敏度：通过精心设计的19组特异性引物和taqman探针，并经过严格的生物信息学分析和实验验证，确保了各病原体靶标之间的扩增无相互干扰，且对各类病原体均具有高度的特异性和10拷贝级的检测灵敏度。

20、结果判读直观：采用按病原体类别（病毒/joe，细菌/fam，寄生虫/rox）分配荧光通道的策略，使结果输出更加清晰、有条理，便于自动化分析和报告生成。

21、内置质控可靠：引入小鼠actb基因作为内参，可有效监控从核酸提取到pcr扩增的全过程，避免假阴性结果，保证检测结果的可靠性。

22、应用前景广泛：本发明提供的试剂盒和方法操作简便、快速（可在2小时内完成）、通量高，非常适用于实验动物生产单位、使用单位、质检机构进行大规模的小鼠群体健康监测、微生物学质量控制和进口动物的检疫筛查。