使用工程化乳杆菌属细菌治疗癌症的方法

本发明总体而言涉及治疗癌症的方法，并且更特别地涉及使用乳杆菌属细菌治疗癌症的方法，所述乳杆菌属细菌已经被工程化为展示用于结合药物的捕获结构域。

背景技术：

1、化疗在各种癌症的治疗中，尤其是在减少远处转移方面，起着关键作用。然而，化疗方案因其在某些肿瘤部位的生物利用度差、显著的全身毒性和患者耐受性低而为人所知。对于许多患者来说，延长的化疗是无法忍受的，因此，远处转移已经成为许多癌症治疗失败的首要原因。因此，需要能够靶向递送和局部释放抗癌治疗剂的药物递送载体，以提高癌症治疗的有效性并允许化疗方案的降级。

2、前药是药理活性很小的分子，其可以在体内通过化学或酶促反应转化为活性原药。通过利用肿瘤微环境（tme）独特的生理条件，可以实现前药的更高选择性。在这种情况下，细胞毒性药物经对tme信号（cue）有响应的化学基团修饰，并在以位点特异性方式到达肿瘤时释放。这是通过识别肿瘤特异性标记物如由抗体缀合的药物（adc）靶向的抗原或受体来实现的。迄今为止，已有14种adc获得美国食品药品监督管理局（fda）的癌症治疗市场批准，标志着靶向癌症疗法的重大进步（fu等人, 2022）。

3、然而，目前的前药策略具有有限的靶标特异性。例如，tme信号与正常组织无法明确区分，这导致前药中显著的脱靶效应。此外，缀合的肿瘤靶向载体（carrier）的大分子性质通常使前药在循环中的药代动力学概况复杂化，影响前药的生物分布、代谢和清除。在adc的情况下，将抗体载体与原药缀合显著增加了分子的大小，这损害了药物在肿瘤中的渗透和生物利用度（xu等人, 2015）。载体抗体较长的半衰期也延长了有效载荷药物在体内的清除，损害肝和肾功能（khera等人, 2018）。除了化疗引起的全身毒性外，adc的全身施用可引入来自抗体组分的毒性，从而诱导免疫应答并引起严重的继发性损伤，导致患者的肾毒性（mecklenburg等人, 2018）。若干临床前研究也揭示了各种纳米材料载体的类似并发症和副作用（cheng等人, 2021）。

4、期望克服或减轻上述问题中的至少一个，或至少提供有用的替代方案。

5、本发明是根据以上考虑而设计的。

技术实现思路

1、为了克服源于有限的治疗特异性和相关并发症的限制，诸位发明人发现并利用肿瘤微生物组内细菌与癌细胞之间的内在相互作用来精确施用前药。诸位发明人假设他们可以精确定位具有癌症结合能力的共生微生物，并对其进行工程化以将前药精确递送至特定癌症部位。有效载荷前药可以通过化学接头与细菌载体缀合，以确保原药的位点特异性释放。使用鼻咽癌（npc）作为癌症的代表性模型，鉴定并表征具有与癌细胞结合的能力的共生微生物，随后对其进行工程化以实现将化疗剂精确递送至癌症部位。npc是最常见的头颈癌，并且在中国南方、东南亚和北非发病率很高，仅在2020年就影响了超过133,000人，并导致超过80,000人死亡（tang等人, 2016）。到2040年，预计全球npc病例和死亡人数将分别上升至大约179,000人和114,000人（zhang等人, 2023）。npc的化疗与严重的毒性和施用困难相关，使患者无法耐受延长的化疗（mcdowell等人, 2020；wang等人, 2019）。

2、在一方面，本文公开了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的携带药物的工程化乳杆菌属细菌，其中所述药物与在所述细菌的表面上展示的捕获结构域结合。在一些实施方案中，所述细菌源自癌组织或可发生癌症的组织。在优选的实施方案中，所述细菌为植物乳杆菌（lp）物种。在一些实施方案中，所述lp为菌株wcfs1。在一些实施方案中，所述细菌在所述细菌的表面上包含oppa多肽。所述oppa多肽可以是不由非工程化细菌表达的外源多肽或由非工程化细菌表达的内源多肽。所述oppa多肽可以是添加到细菌中并包被在细菌的表面上的纯化或半纯化制剂。所述oppa多肽可以共价或非共价附着至细菌的表面。所述oppa多肽可以附着至细菌的细胞壁或细胞膜。所述细菌可含有一种或多种oppa多肽。在一些实施方案中，所述oppa多肽包含与seq id no: 1-7所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。

3、在一些实施方案中，所述药物包含能够结合捕获结构域的标签。在一些实施方案中，所述捕获结构域是生物素结合多肽，并且所述标签是生物素。在一些实施方案中，生物素结合多肽是链霉亲和素。在一些实施方案中，所述捕获结构域包含用于锚定到所述细菌表面的锚定结构域。在一些实施方案中，所述锚定结构域是细菌跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细菌跨膜结构域包含与seq id no: 8所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。

4、在一些实施方案中，所述药物是包含可裂解实体的前药。在一些实施方案中，所述前药通过所述可裂解实体的裂解在癌细胞或癌组织附近被活化。在一些实施方案中，所述可裂解实体是氧化还原敏感实体。在一些实施方案中，将所述细菌通过粘膜、肿瘤周围或肿瘤内施用。

5、在一些实施方案中，所述癌症是癌。在一些实施方案中，所述癌症是鼻咽癌、口腔癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、结直肠癌、皮肤癌、乳腺癌或卵巢癌。在优选的实施方案中，所述癌症是鼻咽癌。

6、在第二方面，本文公开了一种携带癌症药物的工程化乳杆菌属细菌，用于治疗受试者的癌症，其中所述药物与在所述细菌的表面上展示的捕获结构域结合。

7、在第三方面，本文公开了携带癌症药物的工程化乳杆菌属细菌在制造用于治疗受试者的癌症的药剂中的用途，其中所述药物与在所述细菌的表面上展示的捕获结构域结合。

8、在第四方面，本文公开了一种将药物递送至癌细胞的方法，所述方法包括使所述癌细胞与携带所述药物的乳杆菌属细菌接触，其中所述药物与在所述细菌的表面上展示的捕获结构域结合。

9、在第五方面，本文公开了一种检测受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的携带可检测标记的工程化乳杆菌属细菌，其中所述可检测标记与在所述细菌的表面上展示的捕获结构域结合。

10、在第六方面，本文公开了一种标记癌细胞的方法，所述方法包括使所述癌细胞与携带可检测标记的乳杆菌属细菌接触，其中所述可检测标记与在所述细菌的表面上展示的捕获结构域结合。

11、在第七方面，本文公开了一种工程化乳杆菌属细菌，所述工程化乳杆菌属细菌包含a) 异源核酸分子，所述异源核酸分子编码包含在所述细菌的表面上展示的捕获结构域的多肽；和b) 与所述捕获结构域结合的异源部分。在一些实施方案中，所述细菌是植物乳杆菌（lp）。在一些实施方案中，所述lp为菌株wcfs1。在一些实施方案中，所述细菌在所述细菌的表面上包含oppa多肽。所述oppa多肽可以是不由非工程化细菌表达的外源多肽或由非工程化细菌表达的内源多肽。所述oppa多肽可以是添加到细菌中并包被在细菌的表面上的纯化或半纯化制剂。所述oppa多肽可以共价或非共价附着至细菌的表面。所述oppa多肽可以附着至细菌的细胞壁或细胞膜。所述细菌可含有一种或多种oppa多肽。在一些实施方案中，所述oppa多肽包含与seq id no: 1-7所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。

12、在一些实施方案中，所述异源部分包含能够结合捕获结构域的标签。在一些实施方案中，所述捕获结构域包含生物素结合多肽，并且所述标签是生物素。在一些实施方案中，所述生物素结合多肽是链霉亲和素。在一些实施方案中，所述异源部分是药物。在一些实施方案中，所述药物是包含可裂解实体的前药。在一些实施方案中，所述异源部分包含可检测标记。在一些实施方案中，所述细菌还包含在所述细菌的表面上的oppa多肽。

13、在第八方面，本文公开了一种组合物，所述组合物包含第七方面的乳杆菌属细菌。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种乳杆菌属细菌。

14、在第九方面，本文公开了第七方面的乳杆菌属细菌或第八方面的组合物，用作药剂。

15、在第十方面，本文公开了一种制备第七方面的工程化乳杆菌属细菌的方法，所述方法包括：a) 在所述细菌中表达包含在所述细菌的表面上展示的捕获结构域的多肽；以及b) 使所述细菌与能够结合所述捕获结构域的异源部分接触。

16、在第十一方面，本文公开了包含第七方面的细菌的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有根据第八方面的第一组合物的第一容器和含有根据第八方面的第二组合物的第二容器，其中由所述第一组合物的细菌携带的药物包含与由所述第二组合物的细菌携带的药物不同的药物。

17、在一个实施方案中，乳杆菌属细菌还被工程化以产生和/或携带药物，以用于鼻内药物递送至嗅区、脑和cns。在优选的实施方案中，所述药物是前药。在一些实施方案中，所述细菌被工程化以分泌药物，优选在鼻内施用后在鼻内部位（例如，嗅上皮）处分泌。所述细菌可包含一种或多种表达构建体，所述一种或多种表达构建体编码异源药物分子（例如，重组肽或多肽）或编码合成异源药物分子所需的生物合成途径的组分。所述表达构建体可包含编码肽或多肽的一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列可操作地连接至能够引导所述序列在乳杆菌属宿主中表达的相同或不同启动子中的一个或多个。根据本发明方法使用的启动子优选在细菌中组成型表达。组成型启动子的使用避免了为使得表达发生而提供诱导物或其他调节信号的需求。启动子也可以是诱导型启动子，优选在鼻内部位发现的条件下可诱导的启动子。启动子可以与所用细菌同源，即在那些细菌中天然发现的启动子。优选地，启动子以细菌宿主细胞保持活力的水平引导表达，即，即使没有维持生长，也保持一定的代谢活性。

18、本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非在明显不允许或明确避免这样的组合的情况下。