胶原三肽组合物及其制备方法与应用

本发明属于胶原肽，具体涉及胶原三肽组合物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、动物皮料在胶原组织状态、纤维束致密程度、交联/聚集状态、脂肪及非胶原杂质含量等方面存在差异，这些差异会影响酶对底物的可及性和作用阶段。对于高致密动物皮料，由于不同动物皮料的组织结构、胶原聚集/交联状态、热稳定性和杂质组成不同，导致酶在实际酶解过程中所起的作用不同，复合酶无法在不同动物皮料中均具有良好的酶解效果，体现在目标三肽的占比偏低。

2、高致密动物皮料如猪皮、牦牛皮和鳄鱼皮，其胶原的热稳定性和结构可及性受到端肽、聚集状态和交联程度显著影响，其胶原通常以更复杂的胶原纤维束、交联胶原及复合组织结构存在。

3、现有技术通过分步酶解制备胶原三肽，但由于不同高致密动物皮料容易出现胶原纤维束解离不足、胶原酶识别位点暴露不足，而且在等待和后续酶解过程中，部分中间肽不能及时被继续切割，最终以四肽及以上肽段的形式残留在酶解产物中，使目标三肽在小分子肽段中的相对比例降低。阶段性形成浓度较高、组成不断变化的中间肽底物池，可能使不同酶之间产生底物竞争，并造成不同批次间底物组成和酶解程度波动，使目标三肽的生成比例和肽段谱稳定性降低。且疏水性中间肽若不能及时继续转化，可能增加苦味肽或其他不利风味肽段的积累，增加后续脱苦和风味修饰的负担。最终导致中间寡肽阶段性积累、三肽生成效率不稳定以及风味劣变等技术问题。因此，开发一种可以适用不同动物皮料的制备胶原三肽的方法具有广阔应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供胶原三肽组合物的制备方法，以解决现有技术中胶原三肽的制备中胶原纤维束解离不足、中间寡肽阶段性积累、三肽生成效率不稳定的技术问题，还解决了现有方法由于不同动物皮料结构的差异性无法适配多种高致密动物皮料的技术问题。

2、根据本发明的第一个方面，提供胶原三肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)将动物皮料浸入水，向水加入碱性处理剂，在ph为10~11、40℃的条件下超声处理90 min，清水漂洗，然后向动物皮料加入酸性处理剂，在ph为3.5~3.8、40℃的条件下处理90 min，再次清水漂洗；

4、(2)将步骤(1)所得动物皮料浸入水，加入脂肪酶，在ph为5.0~7.5、45℃的条件下处理120min，清水漂洗，得到预处理的动物皮料；

5、(3)将步骤(2)所得动物皮料称重，然后将动物皮料加入水，灭菌，然后以2℃/min速率降温至55℃，然后向动物皮料加入复合酶制剂，在ph为6.3~7.0、50~55℃的条件下反应4-6 h并控制水解度为20%~28%，得到酶解液；

6、(4)将酶解液灭活，再向酶解液加入β-环糊精与吸附剂，过滤，浓缩并冷冻干燥滤液，即得；

7、其中，动物皮料选自猪皮、鳄鱼皮、牦牛皮中的至少一种；以质量百分比计，复合酶制剂主要由20%~35%胶原酶、25%~35%碱性蛋白酶、10%~15%中性蛋白酶、15%~20%风味蛋白酶、5%~10%植物蛋白酶组成。

8、本发明先通过弱碱、弱酸、超声和脂肪酶处理对动物皮料进行脱脂除杂和结构松散；随后通过95℃焖煮使蛋白质变性，初步打开胶原三螺旋和纤维束结构；接着以胶原酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和植物蛋白酶组合作为复合酶酶制剂用于不同动物皮料的酶解，所得胶原三肽组合物中胶原三肽占比高。具体地，本发明中在动物皮料的预处理阶段使用脂肪酶，其主要作用是水解部分脂质、降低脂肪包埋、减少脂质氧化异味，并提高后续蛋白酶对胶原底物的可及性，另一方面减少脂质氧化或异味物质对产物品质如风味的影响。碱性蛋白酶、中性蛋白酶和植物蛋白酶是对高致密物皮料中的非胶原蛋白、胶原非螺旋区和已松散胶原结构进行预切割，使胶原纤维束逐步解离并暴露胶原酶识别位点。与此同时，胶原酶在胶原结构暴露过程中同步进行定向切割，促进目标三肽生成。多种酶协同提高目标三肽的生成。风味蛋白酶则是进一步对同步酶解过程中产生的中间肽进行末端修饰，减少苦味肽和疏水肽积累，改善产物风味。β-环糊精和活性炭先后分步加入，是由于二者作用机制不同。β-环糊精主要用于包埋异味小分子和部分脂质氧化相关风味物质；活性炭主要用于吸附色素、残余异味物质和不利于产品感官品质的疏水性杂质。先进行β-环糊精包埋，再进行活性炭吸附，可避免活性炭提前吸附β-环糊精或其包合物，并有利于分别发挥包埋和吸附作用。

9、本方案的复合酶制剂是针对高致密动物皮料建立的结构暴露、主链切割、胶原酶定向切割、末端修饰和风味改善的连续协同体系，因此，本发明的复合酶制剂是针对特定动物皮料胶原结构和产品质量要求进行的适配性设计。

10、在一些实施方式中，碱性处理剂包括碳酸钠与乙二胺四乙酸二钠。碱性处理剂中，碳酸钠的质量分数为0.3%~0.5%；乙二胺四乙酸二钠的质量分数为0.03%~0.05%。

11、在一些实施方式中，酸性处理剂包括柠檬酸与抗坏血酸。酸性处理剂中，柠檬酸的质量分数为0.5%~0.8%，抗坏血酸的质量分数为0.03%~0.05%。

12、在一些实施方式中，植物蛋白酶由木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶组成。

13、在一些实施方式中，胶原酶的酶活为1000~100000 u/g；碱性蛋白酶的酶活为50000~300000 u/g；中性蛋白酶的酶活为30000~200000 u/g；风味蛋白酶的酶活为10000~100000 u/g；木瓜蛋白酶的酶活为300000~1000000 u/g；菠萝蛋白酶的酶活为200000~1200000 u/g；脂肪酶的酶活为10000~100000 u/g。

14、在一些实施方式中，当动物皮料为猪皮时，以质量百分比计，复合酶制剂包括：20%胶原酶、35%碱性蛋白酶、15%中性蛋白酶、20%风味蛋白酶、5%木瓜蛋白酶、5%菠萝蛋白酶。猪皮中的脂肪和胶原蛋白含量高，提高碱性蛋白酶和风味蛋白酶的比例的目的在于，减少脂肪包埋和非胶原蛋白会阻碍蛋白酶与胶原底物接触，并减少并增加脂质氧化异味、苦味肽和非目标肽段生成风险。提高碱性蛋白酶比例，有利于破坏非胶原基质、促进组织松散和胶原暴露；提高风味蛋白酶比例，有利于降低苦味肽、疏水肽和异味物质积累；同时猪皮经脱脂和热变性后胶原较易暴露，复合酶制剂中胶原酶比例相对较少，以避免过度水解或非目标短肽增加。

15、在一些实施方式中，当动物皮料为鳄鱼皮时，以质量百分比计，复合酶制剂包括：25%胶原酶、30%碱性蛋白酶、15%中性蛋白酶、20%风味蛋白酶、5%木瓜蛋白酶和5%菠萝蛋白酶。之所以胶原酶在鳄鱼皮所用复合酶制剂中的质量相对于猪皮所用复合酶制剂的质量提高，是因为鳄鱼皮具有较强韧性和较致密真皮结构，胶原网络较难完全打开，需要增加胶原酶以实现对鳄鱼皮具有较强韧性和较致密真皮结构，胶原网络较难完全打开。同时碱性蛋白酶含量的调整有助于破坏非胶原基质、促进组织松散和胶原暴露。

16、在一些实施方式中，当动物皮料为牦牛皮时，以质量百分比计，复合酶制剂包括：35%胶原酶、25%碱性蛋白酶、10%中性蛋白酶、15%风味蛋白酶、7.5%木瓜蛋白酶和7.5%菠萝蛋白酶。牦牛皮所用复合酶制剂中胶原酶的含量之所以进一步提高，是因为牦牛皮的胶原纤维束更紧密，胶原酶识别位点更不易充分暴露。

17、在一些实施方式中，步骤(1)中，动物皮料与水的质量比为1：（0.8-1.0）。具体地，当动物皮料为猪皮或牦牛皮时，动物皮料与水的质量比为1：0.8。当动物皮料为鳄鱼皮时，动物皮料与水的质量比为1：1.0。

18、不同动物皮料与水的质量比不同，主要是根据不同皮料的含水量、组织致密程度、胶原纤维束吸水膨胀能力、脂肪含量以及酶解体系流动性进行调整。猪皮脂肪含量较高、热处理后容易形成较黏稠的胶原/明胶样体系，且预处理后组织较易软化，因此加水量不宜过高。将猪皮与纯水的质量比设置为1:0.8，既能保证猪皮在焖煮热变性和复合酶解阶段具有足够水相环境，又能避免体系过度稀释导致酶与底物接触效率降低、后续浓缩负担增加。鳄鱼皮含脂量较低但真皮组织韧性较强，含有鳞片、角质化组织及较致密胶原纤维束，热变性和酶解过程中需要较充分的水化和膨润环境，因此鳄鱼皮与纯水的质量比设置为1:1.0，以提高组织水化程度、改善体系流动性，并有利于复合酶向胶原纤维束内部扩散。牦牛皮胶原纤维束较致密，蛋白质和脂肪含量相对较高，热变性后体系黏度较大，若加水过少，会影响搅拌、传热和复合酶分散；若加水过多，则会降低底物浓度并增加后续浓缩负担。因此，将牦牛皮与纯水的质量比设置为1:0.8，用于兼顾体系流动性、酶解效率和后处理负担。综上，不同动物皮料与水的质量比并非任意设置，而是基于不同皮料的水分含量、脂肪含量、组织致密程度、吸水膨润能力和酶解体系黏度进行的适配性调整。其目的在于保证热变性和复合酶解过程中底物能够充分水化、酶制剂能够均匀分散，同时避免过度稀释导致酶解效率下降和后续浓缩成本增加。

19、在一些实施方式中，步骤(2)中，脂肪酶的用量为步骤(1)所得动物皮料质量的0.1%~0.15%。优选地，脂肪酶的用量为动物皮料质量的0.1%。

20、在一些实施方式中，步骤(3)中，复合酶制剂的用量为步骤(2)所得动物皮料质量的0.5%~0.7%。优选地，复合酶制剂的用量为动物皮料质量的0.5%。

21、在一些实施方式中，步骤(3)中，β-环糊精的用量为酶解液质量的1%~3%。优选地，β-环糊精的用量为酶解液质量的1%。

22、在一些实施方式中，步骤(3)中，吸附剂为活性炭。吸附剂的用量为酶解液质量的0.5%~0.7%。优选地，吸附剂的用量为酶解液质量的0.5%。

23、根据本发明的第二个方面，提供上述制备方法制备得到的胶原三肽组合物。

24、在一些实施方式中，胶原三肽组合物中，三肽的数量占3-5氨基酸肽段总数量的50%~60%，三肽的相对丰度为3-5氨基酸肽段相对丰度的60%~70%。

25、在一些实施方式中，3-5氨基酸肽段由三肽、四肽与五肽组成。

26、相对丰度为基于lc-ms/ms检测获得的峰面积、峰强度或intensity值计算得到的相对响应值。由于不同检测报告对信号响应的命名可能存在差异，包括峰面积、峰强度、intensity等。

27、根据本发明的第三个方面，提供上述胶原三肽组合物在制备美白、抗炎舒缓、抗细胞衰老药物中的应用。

28、本发明的有益效果为：

29、(1)与现有分步酶解工艺相比，本发明使用复合酶制剂在同一反应环境中同时发挥结构暴露、主链切割、胶原酶定向切割和末端修饰作用。酶产生的中间肽可以在同一反应体系中及时成为另一类酶的底物，后续无需重新加酶，从而减少由四个及以上氨基酸残基组成的非目标中间肽段在某一酶解阶段的大量停留和阶段性积累。也就是说，本技术通过同步复合酶解形成动态底物池，使中间肽能够持续转化，而不是先大量积累中间寡肽后再进行后续处理。

30、(2)本发明针对高脂高致密动物皮料，通过复合酶制剂的结合与质量比例的选择，在酶解中提高胶原酶识别位点的暴露程度与胶原纤维束解离，通过复合酶制剂同步酶解避免中间寡肽阶段性积累，通过水解度的控制避免过度水解导致目标三肽继续降解为二肽或游离氨基酸，利用动物皮料酸碱预处理、脂肪酶辅助脱脂、热变性、复合酶同步酶解、水解度控制及纯化成型共同构成的整体工艺组合提高三肽的含量。

31、(3)本发明制备得到的胶原三肽肽组合物具有三肽富集特征，三肽的数量占3-5氨基酸肽段总数量的50%~60%，三肽的相对丰度为3-5氨基酸肽段相对丰度的60%~70%。