蔗糖磷酸化酶突变体及其编码核酸与制备方法、含编码核酸的载体和细胞、含有其的酶制剂以及葡萄糖-1-磷酸的制备方法与流程

本申请涉及生物工程，特别涉及蔗糖磷酸化酶突变体及其编码核酸与制备方法、含编码核酸的载体和细胞、含有其的酶制剂以及葡萄糖-1-磷酸的制备方法。

背景技术：

1、蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，spase，ec 2.4.1.7）属于糖苷水解酶gh13家族。蔗糖磷酸化酶可以催化以下三个反应：（1）以蔗糖和磷酸盐为底物，发生磷酸解反应，转化为果糖与葡萄糖-1-磷酸；（2）以蔗糖为底物发生水解反应生成葡萄糖和果糖；（3）以蔗糖和醇类化合物为底物，发生转糖苷反应，生成相应的糖苷类化合物和一分子果糖。

2、蔗糖磷酸化酶（sp）的催化机理是通过双位点反应机制实现的，羧基残基攻击蔗糖的异头碳原子，产生共价β-葡萄糖基酶中间体，释放果糖。随后受体化合物与中间体反应，生成α-d-葡萄糖基化合物。

3、然而，野生型sp的天然酶学特性的催化活性较低，难以满足工业应用需求。

技术实现思路

1、基于此，本申请的一个或者多个实施例提供了蔗糖磷酸化酶突变体及其编码核酸与制备方法、含编码核酸的载体和细胞、含有其的酶制剂以及葡萄糖-1-磷酸的制备方法。包括以下技术方案：

2、本申请的一个或者多个实施例提供蔗糖磷酸化酶突变体，相对于野生型蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶突变体具有f156g氨基酸替换。

3、在本申请的一些实施方式中，所述野生型蔗糖磷酸化酶来源于青春双歧杆菌；

4、可选地，所述野生型蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；

5、可选地，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。

6、在本申请的一些实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶突变体的n端连接有纯化标签；

7、可选地，所述纯化标签包括his tag。

8、本申请的一个或者多个实施例提供核酸分子，所述核酸分子编码所述的蔗糖磷酸化酶突变体；

9、可选地，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.4所示。

10、本申请的一个或者多个实施例提供载体，所述载体包含所述的核酸分子；

11、可选地，所述载体包括质粒。

12、本申请的一个或者多个实施例提供细胞，所述细胞表达所述的蔗糖磷酸化酶突变体，包含所述的核酸分子或者所述的载体；

13、可选地，所述细胞包括微生物。

14、本申请的一个或者多个实施例提供所述的蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

15、对所述的细胞进行发酵，从发酵产物中分离含所述蔗糖磷酸化酶突变体的酶液。

16、在本申请的一些实施方式中，发酵包括对所述细胞进行扩增培养以及诱导表达所述蔗糖磷酸化酶突变体的步骤；

17、可选地，发酵满足以下（a1）至（a4）所示条件中的一个或者多个，或者满足以下（b1）至（b4）所示条件中的一个或者多个：

18、（a1）扩增培养的温度为35℃~39℃ ；

19、（a2）扩增培养至培养体系的od600为0.6~0.8的条件下加入诱导剂进行诱导表达，诱导表达的初始体系中诱导剂的终浓度为0.1 mmol/l~1 mmol/l；

20、（a3）诱导表达的温度为12℃~18℃，诱导表达的时间为16h~20h；

21、（a4）发酵采用的培养基包含8 g/l～12 g/l胰蛋白胨、8 g/l～12 g/l氯化钠和4g/l～6 g/l酵母粉；

22、（b1）扩增培养的温度为28℃~30℃，扩增培养的时间为16h~18h；

23、（b2）诱导表达的初始体系中诱导剂的终浓度为0.3%～3%；

24、（b3）诱导表达的温度为28℃~30℃，诱导表达的时间为4d～7d；

25、（b4）发酵采用的培养基包含18 g/l~22 g/l胰蛋白胨、8 g/l~12 g/l酵母粉、18ml/l~22 ml/l甘油、5 g/l~8 g/l ynb、0.3 mg/l~0.5 mg/l生物素和0.05 m~0.15 m磷酸钾缓冲液。

26、本申请的一个或者多个实施例提供酶制剂，所述酶制剂包含所述的蔗糖磷酸化酶突变体或者所定义的酶液。

27、本申请的一个或者多个实施例提供葡萄糖-1-磷酸的制备方法，采用所述的蔗糖磷酸化酶突变体或者所定义的酶液催化蔗糖和磷酸盐，制备葡萄糖-1-磷酸。

28、相对于传统技术，本申请具有以下有益效果：

29、本申请提供了蔗糖磷酸化酶突变体及其编码核酸与制备方法、含编码核酸的载体和细胞、含有其的酶制剂以及葡萄糖-1-磷酸的制备方法。相对于野生型蔗糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶突变体具有f156g氨基酸替换。该突变体相对于野生型酶的酶活显著提升，能用于制备葡萄糖-1-磷酸。

1.蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，相对于野生型蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶突变体具有f156g氨基酸替换。

2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，所述野生型蔗糖磷酸化酶来源于青春双歧杆菌；

3.根据权利要求1或2所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突变体的n端连接有纯化标签；

4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1至3中任一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体；

5.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4所述的核酸分子；

6.细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1至3中任一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体，包含权利要求4所述的核酸分子或者权利要求5所述的载体；

7.权利要求1至3中任一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，其特征在于，发酵包括对所述细胞进行扩增培养以及诱导表达所述蔗糖磷酸化酶突变体的步骤；

9.酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1至3中任一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体或者权利要求7至8中任一项所定义的酶液。

10.葡萄糖-1-磷酸的制备方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体或者权利要求7至8中任一项所定义的酶液催化蔗糖和磷酸盐，制备葡萄糖-1-磷酸。