一种P450单加氧酶突变体及其合成手性芳基-γ-羟基酸酯类化合物的方法

本发明涉及酶工程，具体涉及一种p450单加氧酶突变体及其合成手性芳基-

γ-羟基酸酯类化合物的方法。

背景技术：

1、手性

γ-羟基酸酯是化学合成中一类重要的手性合成切块，它们广泛应用于化学合成、医药、材料、食品等领域。该结构具有酯基和羟基两个基本官能团，可以自身内酯化生成具有生物活性的化学中间体，也可以在化学合成中将羟基或酯基进一步转化为其他复杂结构的药物或天然化合物分子。

2、目前，手性

γ-羟基酸酯类化合物的合成方法主要分为化学不对称合成和生物催化两大类。其中，化学催化法主要依赖金属试剂（如：ru、pd、ir），其反应中需要h2参与，因此反应需要在严格的无水无氧条件下进行；同时，金属催化剂对c-h键的直接羟基化能力不足，需多步反应合成手性芳基-

γ-羟基酸酯，原子经济性低，副产物难以分离。

3、近年来，生物催化方法合成手性

γ-羟基酸酯已有报道，相较于化学合成而言，生物催化方法操作简单，反应条件温和，且化学选择性、区域选择性及立体选择性强，副产物少。但现有的生物催化方法主要是以

γ-酮酸/酯为底物，通过酶催化不对称还原合成了一系列手性烷基和芳基羟基酸酯或内酯；这些方法在很大程度上仍然依赖于底物的预功能化，因此，在不添加额外氧化剂的条件下，直接羟基化未活化的（

sp³）c-h键以合成光学纯芳基-

γ-羟基酸酯仍然具有挑战性。

技术实现思路

1、针对上述现状，本发明提供一种手性

γ-羟基酸酯类化合物的生物合成方法，本发明通过设计p450单加氧酶突变体，以解决现有技术中需通过前体结构或额外添加氧化剂制备芳基-

γ-羟基酸酯，而无法简单、直接羟基化c-h键合成具有对映选择性芳基-

γ-羟基酸酯的问题。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明的第一方面，一种p450单加氧酶突变体，命名为p450vaq羟化酶，其氨基酸序列如seq id no .1所示。

4、本发明的第二方面，在本发明提供了上述p450vaq羟化酶氨基酸序列的情况下，还提供了一种分离的核酸分子，编码上述的p450vaq羟化酶。分离的核酸分子的核苷酸序列如seq id no .2所示。

5、本发明的第三方面，提供一类生物催化剂，其包括第一方面所述的p450单加氧酶突变体。

6、本发明的第四方面，提供了所述的p450单加氧酶突变体或所述生物催化剂在合成手性芳基-

γ-羟基酸酯类化合物中的应用。

7、具体的，p450单加氧酶突变体合成手性芳基-γ-羟基酸酯类化合物的方法是：以4-芳基丁酸酯为底物，加入所述p450单加氧酶突变体或所述生物催化剂，在水相条件下反应得到反应液，然后离心，收集上清液并萃取、浓缩，即得具有对映选择性的芳基-γ-羟基酸酯类化合物，反应式如下：

8、

9、其中：r1为氢、氟、氯、溴、甲基或甲氧基；r2为乙基。

10、该反应的产物采用如与手性芳基-

γ-羟基酸酯类化合物相容的有机溶剂为萃取剂，例如酯类、醚类、醇类，通过柱层析以获得纯化后的手性芳基-

γ-羟基酸酯类化合物。

11、优选的，作为一种改进，所述催化剂为含有p450单加氧酶突变体的重组细胞。

12、优选的，作为一种改进，反应液中所述重组细胞的细胞干重浓度为5 ~ 20 g/l，优选为15 g/l。

13、作为一种改进，所述催化体系缓冲液的浓度为50 mm，选自磷酸盐、柠檬酸盐和甘氨酸-氢氧化纳缓冲液中的任意一种，ph为5.5 ~7.5，反应温度为10 ℃～40℃，反应时间为2 ~ 48 h；所述4-芳基丁酸酯的反应浓度为2 ~ 8 mm。

14、所述催化体系缓冲液为50 mm柠檬酸盐缓冲液，ph为6.5，反应温度为10℃，时间为10h；所述4-芳基丁酸酯的反应浓度为2 mm。

15、本发明的第五方面，提供一种载体，其包含权利要求1所述的p450单加氧酶基因。

16、本发明的第六方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞以细菌为宿主，包含第五方面所述的载体。

17、本发明的第七方面，提供一种菌株，其表达第一方面所述的p450单加氧酶突变体。

18、本发明的有益效果是：本发明采用温和、绿色的细胞素色p450vaq羟化酶催化剂实现催化非活化的（

sp³）c-h键合成手性芳基-γ-羟基酸酯类化合物，相对于现有手性芳基-γ-羟基酸酯类化合物的制备方法，本发明提供的p450vaq羟化酶在合手性芳基-γ-羟基酸酯类化合物时，不需使用金属、复杂的配体、强氧化剂或有毒试剂；本发明的反应方法对复杂合成设备的依赖性低，操作参数调控简便。因此，本发明提供的p450vaq羟化酶具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便，具有广阔的应用前景。

1. 一种p450单加氧酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no .1所示。

2.一类生物催化剂，其特征在于，包括权利要求1所述的p450单加氧酶突变体。

3.权利要求1所述的p450单加氧酶突变体或权利要求2所述生物催化剂在合成手性芳基-γ-羟基酸酯类化合物中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，以4-芳基丁酸酯为底物，加入所述p450单加氧酶突变体或所述生物催化剂，在水相条件下反应合成具有对映选择性的芳基-γ-羟基酸酯类化合物，反应式如下：

5.如权利要求4所述的应用，特征在于，所述生物催化剂为含有p450单加氧酶突变体的重组细胞。

6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，反应液中所述重组细胞的细胞干重浓度为5~ 20 g/l。

7. 如权利要求3所述的应用，特征在于，所述催化体系缓冲液的浓度为50 mm，选自磷酸盐、柠檬酸盐和甘氨酸-氢氧化纳缓冲液中的任意一种，ph为5.5 ~7.5，反应温度为10 ℃～40℃；所述4-芳基丁酸酯的反应浓度为2 ~ 8 mm。

8.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述的p450单加氧酶基因。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌为宿主，包含权利要求4所述的载体。

10.一种菌株，其特征在于，表达权利要求1所述的p450单加氧酶突变体。