一种超氧化物歧化酶活性的快速检测方法

本发明公开了一种超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，属于生物传感与分析检测。

背景技术：

1、超氧化物歧化酶（sod）作为机体抗氧化防御系统的核心酶，其活性水平与各种氧化应激类疾病（如糖尿病并发症、神经退行性疾病及恶性肿瘤等）的发生、发展及转移密切相关。同时，sod也是化妆品行业中衡量产品抗氧化功效及质量控制的重要指标之一，其活性检测在化妆品原料筛查、配方优化及成品质量评价中具有关键作用。然而，传统sod活性检测方法普遍存在操作繁琐、动态范围窄、依赖大型仪器等问题，如邻苯三酚自氧化法对反应条件极为敏感，需反复进行ph校准操作；氮蓝四唑光还原法检测范围窄，需进行样品稀释等操作，难以满足现场快速检测与即时评估（poct）的需求。并且传统sod活性检测方法的样品消耗量较大，对于珍贵或微量生物样本的检测存在明显局限。

2、吸附于金属纳米颗粒上的4-氨基苯硫酚（4-atp）在光激发下会由于等离激元介导产生超氧自由基而被氧化为4,4’-二巯基偶氮苯（dmab），而反应体系中sod的存在将抑制该反应。因此，通过表面增强拉曼散射光谱（sers）监测dmab产率的抑制程度，可以实现对sod活性的快速、灵敏检测。

3、然而，现有基于4-atp催化氧化的sod活性检测方案，虽然具有灵敏度高的优势，但由于该反应对微环境极为敏感，传统实验体系中的氧物种易干扰sod活性检测结果的准确性与稳定性。

技术实现思路

1、技术问题：针对上述问题，本发明提出了一种超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，只需注入待测样品，即可完成检测，读出sod活性值，无需反复多次的试剂和样品调试，从而实现快速检测，且样品消耗量低于1微升；并且微流控芯片构建了封闭、可控的反应空间形成物理隔绝屏障，避免了环境空气中氧物种对sod活性检测的干扰，提高检测的准确性和可靠性。

2、技术方案：本发明的一种超氧化物歧化酶活性的快速检测方法包括以下步骤：

3、步骤1：制备用于超氧化物歧化酶sod活性检测的微流控-sers芯片，所述芯片通道内预置有金属纳米颗粒及sod活性指示探针4-氨基苯硫酚4-atp；

4、步骤2：将sod标准品注入所述微流控-sers芯片中；

5、步骤3：对所述sod活性检测微流控-sers芯片进行光激发，使4-atp发生等离激元介导的催化氧化反应转化为4,4’-二巯基偶氮苯dmab；通过采集sers光谱，获得所述标准品的sod活性值并确定校准曲线；

6、步骤4：采用负压驱动方式将实际待测样本一步注入所述sod活性检测微流控-sers芯片中，采集sers光谱，参照校准曲线，获得该样本的sod活性值。

7、其中，

8、所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒或其组合。

9、所述4-atp的浓度为10-3 m ~ 10-7 m，优选浓度为10-5 m。

10、所述sod活性值由4-atp转化为dmab的抑制率表征，定义为：抑制率=（y0-y1）/y0×100%，其中，y0和y1分别为sod不存在和存在时的dmab产率。

11、所述dmab，其产率定义为sers光谱中dmab特征峰强度与4-atp特征峰强度之比。

12、所述sers光谱中dmab的特征峰位于1141 cm-1附近；4-atp的特征峰位于1074 cm-1附近。

13、所述快速检测过程封闭于微流控芯片中，隔绝空气中氧物种对测量的干扰。

14、所述实际待测样本包括含有sod的化妆品，或者含有sod的生物样品。

15、所述含有sod的化妆品包括大宝sod蜜、sod胶原精华液、sod修复粉底；所述含有sod的生物样品包括血液、尿液、血清、血浆、组织匀浆液或细胞裂解液。

16、本发明的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法适用于化妆品样本以及生物样本中sod活性的现场快速筛查与精准定量分析。

17、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

18、1.本发明通过微流控-sers芯片进行sod活性检测，相对于现有技术，如邻苯三酚自氧化法对反应条件极为敏感，需反复进行ph校准操作；氮蓝四唑光还原法检测范围窄，需进行样品稀释等操作。本发明操作简单，无需试剂和样品调试等前处理过程，实现了一步样品注入，sod活性快速读出，可以为待测样本的sod活性值提供即时检测（poct）；并且检测动态范围大，而样品消耗量低于1微升；

19、2.本发明的sod活性检测反应发生于微流控-sers芯片内，微流控芯片构造的封闭的反应环境隔绝了空气中氧物种对反应体系的干扰，因此sod活性检测具有高度的准确性。

1.一种超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒或其组合。

3.根据权利要求2所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述4-atp的浓度为10-3 m ~ 10-7 m，优选浓度为10-5 m。

4.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述sod活性值由4-atp转化为dmab的抑制率表征，定义为：抑制率=（y0-y1）/y0×100%，其中，y0和y1分别为sod不存在和存在时的dmab产率。

5.根据权利要求4所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述dmab，其产率定义为sers光谱中dmab特征峰强度与4-atp特征峰强度之比。

6.根据权利要求5所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述sers光谱中dmab的特征峰位于1141 cm-1附近；4-atp的特征峰位于1074 cm-1附近。

7.根据权利要求6所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述快速检测过程封闭于微流控芯片中，隔绝空气中氧物种对测量的干扰。

8.根据权利要求7所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述实际待测样本包括含有sod的化妆品，或者含有sod的生物样品。

9.根据权利要求8所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述含有sod的化妆品包括大宝sod蜜、sod胶原精华液、sod修复粉底；所述含有sod的生物样品包括血液、尿液、血清、血浆、组织匀浆液或细胞裂解液。

10.一种如权利要求9所述的超氧化物歧化酶活性的快速检测方法的应用，其特征在于，所述方法适用于化妆品样本以及生物样本中sod活性的现场快速筛查与精准定量分析。