核酸级联转导的纳米孔单分子信号增敏系统及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及核酸级联转导的纳米孔单分子信号增敏系统及其应用。

背景技术：

1、纳米孔是孔径处于纳米尺度的微小孔道，能够在单分子水平实时监测待测分子通过纳米孔过程中产生的离子电流变化。纳米孔检测的基本原理是，在一个纳米尺度的孔两端施加恒定的电压，使孔尖处产生稳定的离子电流。当待测物在电压驱动下定向过孔时，由于体积排阻效应，待测物瞬间占据孔内部分离子的位置从而使离子电流发生改变。每一次由单个待测分子进入、通过或离开纳米孔所引起的特征性电流变化，通常可作为一个独立的单分子检测事件。通过对“事件”的阻塞电流、阻塞时间、电流形状、信号频率及电流积分可以分析出其尺寸、结构、电荷、孔道亲和力等信息。与传统的分子检测方法相比，纳米孔具有单分子检测、实时检测、无需荧光或其他外源标记、无需复杂分离操作以及可直接获取分子过孔过程动态信息等特点。同时，基于单分子事件进行数据采集和分析，纳米孔技术具有较高的检测通量和灵活的数据分析能力，在核酸检测、生物分子表征以及单分子分析等领域具有较好的应用前景。

2、间接转导策略能够将原本微弱的目标分子信号转导为更显著的纳米孔信号事件。其基本过程通常包括目标分子识别、信号转导以及纳米孔检测三个步骤。当目标分子存在时，引入能够与目标分子发生特异性反应的探针、信号分子或纳米结构，将目标分子转导为特定的核酸结构，在电压驱动下穿孔时产生显著的离子电流变化，从而间接实现对目标分子的检测。

3、尽管纳米孔技术具有广阔的应用前景，但其在实际检测与应用过程中仍存在一定的技术局限。目标分子穿过纳米孔过程中所引起的离子电流变化幅度及持续穿孔时间，是表征分子穿孔事件的基本特征参数。然而，对于短链核酸、小分子核酸，由于其体积小，穿孔时引起的离子电流阻塞微弱，停留时间较短，并且对于低丰度靶标，信号容易被背景噪声淹没，无法实现高信噪比的分辨。现有增敏策略通常针对特定目标分子进行设计，需要根据不同目标分子的序列、结构及识别方式重新设计相应的识别模块、转导模块及信号放大模块。不同检测对象之间缺乏统一的模块化设计方式，使得同一增敏体系难以直接适用于不同类型或不同序列的目标核酸，导致检测体系的开发周期较长、设计和优化工作量较大，通用性受到限制。

4、因此，开发一个通用性好，模块化程度高，抗干扰能力强，选择性高的固相纳米孔信号增敏系统或方法，显得尤为必要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供核酸级联转导的纳米孔单分子信号增敏系统及其应用。

2、本发明提供了纳米孔单分子信号增敏系统，其包括：检测靶标m、探针m1、探针m2和4个发夹核酸链；

3、所述检测靶标m为来源于病毒x的核酸片段；所述病毒x包括：甲型流感病毒和/或新型冠状病毒；

4、所述探针m1和探针m2用于检测所述检测靶标m且分别与所述检测靶标m的3’端核苷酸、5’端核苷酸存在部分反向互补；

5、所述4个发夹核酸链的核苷酸序列如seq id no:9~ seq id no:12所示。

6、来源于所述甲型流感病毒的检测靶标m的核苷酸序列如seq id no:1所示；

7、来源于所述新型冠状病毒的检测靶标m的核苷酸序列如seq id no:13所示。

8、更进一步的，检测所述来源于所述甲型流感病毒的检测靶标m的探针m1和探针m2的核苷酸序列分别如seq id no:2和seq id no:3所示；

9、检测所述来源于所述新型冠状病毒的检测靶标m的探针m1和探针m2的核苷酸序列分别如seq id no:14和seq id no:15所示。

10、本发明所述的纳米孔单分子信号增敏系统，其还包括：检测靶标n、探针n1、探针n2和2个发夹核酸链；

11、所述检测靶标n为来源于病毒b的核酸片段；所述病毒b包括：甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；

12、所述探针n1和探针n2用于检测所述检测靶标n且分别与所述检测靶标n的3’端核苷酸、5’端核苷酸存在部分反向互补；

13、所述2个发夹核酸链的核苷酸序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示。

14、进一步的，所述病毒包括：甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；

15、来源于所述甲型流感病毒的检测靶标n的核苷酸序列如seq id no:4所示；

16、来源于所述乙型流感病毒的检测靶标n的核苷酸序列如seq id no:16所示。

17、更进一步的，检测所述来源于所述甲型流感病毒的检测靶标n的探针n1和探针n2的核苷酸序列分别如seq id no:5和seq id no:6所示；

18、检测所述来源于所述乙型流感病毒的检测靶标n的探针n1和探针n2的核苷酸序列分别如seq id no:17和seq id no:18所示。

19、在本发明的具体实施例中，所述的纳米孔单分子信号增敏系统，其为针对同一病毒设置两种靶标同时进行hcr和g-hcr反应；

20、具体的，针对甲型流感病毒的纳米孔单分子信号增敏系统（g-hcr与传统hcr的结合）包括：检测靶标m、探针m1、探针m2、4个g-hcr发夹核酸链、检测靶标n、探针n1、探针n2、2个hcr发夹核酸链；

21、所述检测靶标m的核苷酸序列如seq id no:1所示；

22、所述探针m1和探针m2的核苷酸序列分别如seq id no:2和seq id no:3所示；

23、所述4个g-hcr发夹核酸链的核苷酸序列分别如seq id no:9~ seq id no:12所示；

24、所述检测靶标n的核苷酸序列如seq id no:4所示；

25、所述探针n1和探针n2的核苷酸序列分别如seq id no:5和seq id no:6所示；

26、所述所述2个hcr发夹核酸链的核苷酸序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示。

27、通过上述特定的实验设计，h1n1经过转导，仅会产生引发ghcr的i2 ,通过纳米孔检测到ghcr的信号确认h1n1靶标的存在。h5n1经过转导，仅会产生引发传统hcr的i1，通过纳米孔检测到hcr的信号确认h5n1靶标的存在。在h1n1检测时同时加入probe a1和probe a2，probe b1和probe b2，由于识别特异性，probeb1和probe b2并不会干扰h1n1的识别和后续反应。同时检测两种靶标，所有的探针和靶标是同时加入同一管，并不会互相影响，提高了检测的特异性以及病毒分型区分的时间。在一次检测中可对h1n1和h5n1同时检出。

28、针对新型冠状病毒的纳米孔单分子信号增敏系统（g-hcr）包括：检测靶标m、探针m1、探针m2、4个g-hcr发夹核酸链；检测靶标n、探针n1、探针n2、2个hcr发夹核酸链；

29、所述检测靶标m的核苷酸序列如seq id no:13所示；

30、所述探针m1和探针m2的核苷酸序列分别如seq id no:14和seq id no:15所示；

31、所述4个g-hcr发夹核酸链的核苷酸序列分别如seq id no:9~ seq id no:12所示；

32、针对乙型流感病毒的纳米孔单分子信号增敏系统（传统hcr）包括：检测靶标n、探针n1、探针n2、2个hcr发夹核酸链；

33、所述检测靶标n的核苷酸序列如seq id no:16所示；

34、所述探针n1和探针n2的核苷酸序列分别如seq id no:17和seq id no:18所示；

35、所述所述2个hcr发夹核酸链的核苷酸序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示。

36、本发明中，“g-hcr与传统hcr在电流降幅度和穿孔时间有明显区别”旨在阐明这两个产物由于结构不同，通过纳米孔时会产生不同的信号。h1n1经过转导生成引发g-hcr的引发剂，h5n1经过转导生成引发传统hcr的引发剂。经由这样的设计，不同靶标经转导会产生不同的引发剂，引发对应的hcr产物，通过纳米孔进行靶标区分。

37、本发明提供了用于病毒检测信号级联放大的试剂，其包括本发明所述的纳米孔单分子信号增敏系统。

38、本发明所述的试剂还可以包括用于保存所述纳米孔单分子信号增敏系统的试剂；具体包括：缓冲液、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂等，本发明对此不做限定。

39、本发明提供了如下a）~b）所示中的一种在制备病毒检测信号级联放大的试剂盒中的应用：

40、a）、本发明所述的纳米孔单分子信号增敏系统；

41、b）、本发明所述的试剂。

42、本发明提供了病毒检测信号级联放大的试剂盒，其包括本发明所述的纳米孔单分子信号增敏系统或本发明所述的试剂中的至少一种，还包括酶、dntp和/或反应缓冲液；

43、所述酶包括dna聚合酶和核酸内切酶。

44、进一步的，所述dna聚合酶为klenow fragment；

45、所述核酸内切酶为nt.bbvci；

46、本发明中的检测靶标m或检测靶标n，其具体类型为核酸或小分子；其中，所述核酸的来源可以是人工合成、扩增产物或实际样本提取，用于实现对特定靶标的检测，在检测过程中实现信号的级联放大，从而更有利于检测，使检测的灵敏度、特异性升高。本发明检测基于“间接转导策略”，通过3wj结构特异性识别目标分子，并利用sda反应将目标分子转导为hcr引发剂，实现目标分子的间接转导与浓度放大。具体而言，检测靶标m或检测靶标n作为被识别和检测的目标物质，既可以是核酸类物质，也可以是小分子类物质，以适应不同检测场景的需求。对于核酸类靶标，其获取来源并不受特别限制，既可以来源于人工合成，也可以来源于扩增产物，还可以来源于实际样本提取，从而保证检测靶标在实际应用中的可获得性和适用性。在检测过程中，上述检测靶标能够实现信号的级联放大，使得原本较为微弱的检测信号得到有效增强，进而更有利于检测的开展和结果的判定，使检测的灵敏度、特异性得到明显升高。本发明所采用的检测策略为“间接转导策略”，其核心在于通过3wj结构对目标分子进行特异性识别，并利用sda反应将目标分子转导为hcr引发剂，从而实现目标分子的间接转导与浓度放大，进一步提升检测体系的整体性能。

47、本发明中，所述检测靶标（检测靶标m和/或检测靶标n）优选gc比在45%~55%，前16个碱基及后17个碱基的gc比也需满足这个比例。检测靶标自身不存在二聚体。检测靶标具有保守性。

48、本发明利用hcr以及g-hcr实现对目标分子的结构放大，通过纳米孔能够产生显著信号的同时，能对统一体系检测的两种靶标进行区分，节省了样本检测时间、简化了检测流程。

49、本发明将sda的引发剂浓度放大与hcr的结构放大相结合，建立“浓度放大+结构放大”的级联增敏机制。

50、本发明对于不同种类、序列和长度的目标核酸分子，仅需通过调整3wj的识别探针即可，无需重新构建整个检测体系，具有较好的通用性和模块化程度，具有较高的普适性。

51、本发明的有益效果：

52、本发明构建了一个通用性好，模块化程度高，抗干扰能力强，选择性高的固相纳米孔信号增敏系统以及方法。通过将特异性识别、sda浓度放大、hcr/g-hcr结构放大以及固相纳米孔检测进行模块化集成，实现了小尺寸、低丰度核酸靶标的间接检测及不同靶标的区分。