一种用于钩端螺旋体核酸检测的冻干PCR试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种用于钩端螺旋体核酸检测的冻干pcr试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的一种全球性人畜共患传染病，其临床表现复杂，严重时可导致多器官衰竭甚至死亡。因此，建立快速、灵敏、特异的检测方法对于该病的早期诊断和防控具有重要意义。目前，聚合酶链式反应（pcr）技术因其高灵敏度和高特异性，已成为钩端螺旋体核酸检测的主流方法。特别是针对lipl32、16srrna、secy等多个保守基因位点的多重pcr检测，能够有效避免单一靶标变异导致的漏检，显著提高了检测的准确率。

2、然而，现有的钩端螺旋体核酸检测技术在实际应用中仍存在以下显著的局限性：

3、第一，液体试剂对冷链运输和储存的高度依赖。

4、现有的钩端螺旋体pcr检测试剂多以液体形式提供。液体体系中的关键生物活性成分，如taqdna聚合酶、特异性引物、荧光探针及dntps等，在常温下极不稳定。特别是在高温、高湿或长途运输条件下，酶蛋白容易发生变性失活，引物和探针易发生水解或非特异性降解，导致试剂灵敏度大幅下降，甚至出现假阴性结果。这种对低温冷链（-20℃保存，冰袋运输）的严格依赖，不仅大幅增加了物流成本和储存难度，更限制了该技术在缺乏冷链条件的偏远地区、野外疫源地现场以及基层医疗机构的推广应用。

5、第二，多重pcr体系在冻干过程中的稳定性难题。

6、虽然冻干技术理论上可以解决液体试剂的稳定性问题，但将其应用于钩端螺旋体多重核酸检测时面临巨大挑战。与单重pcr相比，多重pcr体系组分更为复杂，同一反应体系中同时存在多对引物、多条探针及多种模板，各组分间极易发生相互作用（如引物二聚体形成、竞争性抑制等）。在常规的冷冻干燥过程中，随着水分的升华，剩余液相中的溶质浓度急剧升高，会导致局部ph值剧烈变化、离子强度失衡，进而引起酶蛋白不可逆变性、引物探针沉淀或空间构象破坏。现有的通用冻干保护剂配方往往难以兼顾多重体系中不同生物大分子的稳定需求，导致冻干粉复溶后扩增效率低、ct值漂移大，甚至完全丧失检测能力。

7、第三，现有冻干工艺参数缺乏针对性，产品均一性差。

8、钩端螺旋体多重pcr反应液的共晶点、玻璃化转变温度等热力学特性与普通单重体系存在差异。现有的冻干工艺多采用通用的升温程序，未能针对该特定多重体系的物理化学性质进行优化。例如，预冻温度不够低导致样品未完全固化，或者主干燥阶段升温过快导致样品塌陷、融化，亦或解析干燥不彻底导致残留水分过高。这些工艺参数的不匹配，直接导致制得的冻干粉外观塌陷、复溶时间长、批间差异大，严重影响试剂盒的检测性能和使用寿命。

9、第四，操作流程繁琐，易造成交叉污染。

10、液体试剂在使用前通常需要复杂的解冻、分装和混合步骤，这不仅增加了操作人员的工作量，更大大增加了开盖次数和气溶胶产生的风险，极易导致实验室内的交叉污染，引发假阳性结果。此外，液体试剂在反复冻融过程中性能会加速衰退，进一步影响了检测结果的可靠性。

11、尽管冻干技术被视为解决上述问题的潜在途径，但现有的通用冻干配方和工艺无法直接适用于钩端螺旋体多重pcr这一复杂体系。具体而言，常规的保护剂无法防止多重引物在脱水过程中的聚集沉淀，通用的缓冲液体系难以维持冻干状态下taq酶的活性，而标准的冻干升温曲线往往导致样品塌陷或残留水分过高。因此，亟需开发一种包含特定缓冲液体系、专用复合保护剂以及优化冻干工艺的钩端螺旋体多重核酸检测冻干试剂盒，通过各组分的协同作用，以同时实现常温长效稳定、高灵敏度多重扩增及操作简便的技术效果。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中钩端螺旋体液体pcr试剂依赖冷链运输储存、多重检测体系在冻干过程中稳定性差、通用冻干工艺导致产品均一性低以及操作流程繁琐易污染等技术问题，提供一种通过特定的多重引物探针组合、优化的pcr缓冲液体系、专用的复合冻干保护剂配方以及针对性的冷冻干燥工艺，实现试剂盒在常温下的长期稳定储存与运输，同时保证对钩端螺旋体多个靶标基因的高灵敏度、高特异性同步检测，并简化操作流程，用于钩端螺旋体核酸检测的冻干pcr试剂盒及其制备方法。

2、为了实现上述发明目的，本技术采用如下技术方案：

3、一种用于钩端螺旋体核酸检测的冻干pcr试剂盒，包括pcrmix冻干粉、阳性对照和阴性对照；

4、所述pcrmix冻干粉是由反应液经冷冻干燥制得，所述反应液包括pcrbuffer缓冲液、酶液、核苷酸混合物、引物探针混合液和冻干保护剂；

5、所述引物探针混合液包含至少一组用于靶向扩增钩端螺旋体特异性基因的引物探针组，所述特异性基因选自外膜脂蛋白lipl32基因、16srrna基因和secy基因中的至少一种；

6、所述引物探针混合液还包含一组用于靶向扩增内标基因actb的引物探针组；

7、所述阳性对照包含含有钩端螺旋体特异性基因序列的质粒和含有人类actb基因序列的质粒；

8、所述阴性对照包含含有人类actb基因序列的质粒，且不含有钩端螺旋体特异性基因序列。

9、进一步的，所述引物探针混合液包含四组特异性引物探针组，分别用于靶向扩增钩端螺旋体的外膜脂蛋白lipl32基因、16srrna基因、secy基因以及内标基因actb。

10、进一步的，所述引物探针混合液包括：

11、第一引物组，用于检测钩端螺旋体外膜脂蛋白lipl32，包含序列如seqidno:1所示的lipl32-f引物、序列如seqidno:2所示的lipl32-r引物和序列如seqidno:3所示的lipl32-p探针；

12、第二引物组，用于检测钩端螺旋体编码核糖体rna（16srrna），包含序列如seqidno:4所示的16srrna-f引物、序列如seqidno:5所示的16srrna-r引物和序列如seqidno:6所示的16srrna-p探针；

13、第三引物组，用于检测钩端螺旋体secy基因，包含序列如seqidno:7所示的secy-f引物、序列如seqidno:8所示的secy-r引物和序列如seqidno:9所示的secy-p探针；

14、第四引物组，用于检测内标基因actb，包含序列如seqidno:10所示的actb-f引物、序列如seqidno:11所示的actb-r引物和序列如seqidno:12所示的actb-p探针。

15、进一步的，所述的pcrbuffer缓冲液包含tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgcl2、brij35和tritonx-100；

16、其中，tris-hcl的浓度为100-200mmol/l；kcl的浓度为500-600mmol/l；(nh4)2so4的浓度为150-200mmol/l；mgcl2的浓度为50-65mmol/l；brij35的浓度为0.05%-0.15%(w/v)；tritonx-100的浓度为0.05%-0.15%(w/v)；ph值为8.0-8.3。

17、进一步的，所述的酶液包括taq聚合酶和udg酶；

18、所述核苷酸混合物包括datp、dttp、dgtp、dctp和dutp。

19、进一步的，所述的所述冻干保护剂包含组氨酸、海藻糖、聚蔗糖70和葡聚糖；

20、其中，组氨酸的浓度为5-10mmol/l；海藻糖的浓度为3-6%(w/v)；聚蔗糖70的浓度为2-3%(w/v)；葡聚糖的浓度为0.1-0.5%(w/v)。

21、进一步的，所述阳性对照为：用体外合成的一条含有钩端螺旋体lipl32基因、16srrna基因、secy基因序列的质粒seqidno:13和一条含有人类actb基因序列的质粒seqidno:14，稀释到浓度为0.4ng/μl获得的溶液。

22、进一步的，所述阴性对照为：用体外合成的一条含有人类actb基因序列的质粒seqidno:14，稀释到浓度为0.4ng/μl获得的溶液。

23、本技术还公开了一种用于钩端螺旋体核酸检测的冻干pcr试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

24、s1配制液体pcr试剂：按配比将pcrbuffer缓冲液、酶液、核苷酸混合物、引物探针混合液、冻干保护剂和depc水混合，形成均一液体；

25、s2分装：将所述液体pcr试剂按照25μl/孔分装到pcr管中；

26、s3冻干：将分装后的pcr管在不盖盖子的情况下进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻阶段、主干燥阶段和解析干燥阶段；

27、s4封装：冻干结束后，在惰性气体环境下密封pcr管，制得pcrmix冻干粉；

28、s5制备阳性对照：将阳性对照的质粒溶液分装到保存管；

29、s6制备阴性对照：将阴性对照的质粒溶液分装到保存管中；

30、s7组装：将pcrmix冻干粉、阳性对照和阴性对照组合成试剂盒。

31、进一步的，所述步骤s3中冷冻干燥的程序包括如下阶段：

32、s3-1预冻阶段：在-50℃至-40℃下冷冻1小时，使样品完全固化；

33、s3-2主干燥阶段：在真空度0.1-0.3mbar的条件下，将温度控制在-50℃至-20℃范围内进行升华干燥4-5小时，以去除自由水；

34、s3-3解析干燥阶段：逐步升高温度，先在-20℃至0℃范围内干燥0.5-1小时，再升温至20-30℃范围内干燥2-4小时，真空度保持在0.1-0.3mbar，以去除结合水。

35、与现有技术相比较，本发明具有如下显著的技术效果：

36、1.优异的常温稳定性，摆脱冷链依赖。

37、本发明通过采用特定的复合冻干保护剂体系，利用各组分间的协同作用，在冻干粉中形成了稳定的玻璃态基质，有效保护了酶蛋白的活性中心及核酸分子的空间结构。这使得试剂盒在常温条件下能够长期保持稳定，显著降低了因温度波动导致的试剂失效风险，从而彻底摆脱了对低温冷链运输和储存的依赖，极大地降低了物流成本，特别适用于偏远地区及野外现场的即时检测。

38、2.多重扩增效率高，检测灵敏度高。

39、针对多重pcr体系组分复杂、易产生干扰的问题，本发明设计了包含特定浓度硫酸铵及复配非离子表面活性剂的专用缓冲液体系。该体系有效优化了反应环境的离子强度和表面张力，抑制了引物二聚体的形成和非特异性扩增，确保了多个靶标基因在同一反应体系中能够均衡、高效地扩增。即使在经过冻干和复溶处理后，试剂盒仍能保持高灵敏度和高特异性，有效避免了漏检和假阴性结果。

40、3.产品外观好，批间一致性高。

41、本发明采用的针对性冻干工艺参数，充分匹配了该特定多重反应体系的热力学特性。通过精确控制预冻温度、升华速率及解析干燥程度，有效避免了冻干过程中常见的样品塌陷、融化或残留水分过高等问题。制得的冻干粉呈疏松多孔状，复溶迅速且完全，显著提高了产品的物理性状稳定性和生产批间的一致性，有利于大规模工业化生产。

42、4.操作简便，降低污染风险。

43、本发明提供的预分装冻干粉形式，简化了实验前的配液和分装步骤，用户只需加入样本即可直接进行检测。这不仅大幅缩短了检测准备时间，提高了检测效率，还最大限度地减少了开盖操作次数，有效降低了气溶胶产生及交叉污染的风险。此外，试剂盒内置的内标系统能够对整个检测过程进行实时监控，进一步保障了检测结果的准确性和可靠性。

44、综上所述，本发明通过组分配方与制备工艺的有机结合，成功解决了钩端螺旋体多重核酸检测在稳定性、灵敏度及便捷性方面的技术难题，具有广阔的临床应用前景。