一种双响应乳酸和N-酰基高丝氨酸内酯的系统及其应用

本发明属于基因工程，涉及一种双响应乳酸和n-酰基高丝氨酸内酯的系统及其应用，具体涉及一种乳酸响应表达系统，基于其构建的双响应乳酸和n-酰基高丝氨酸内酯的系统及其应用。

背景技术：

1、近年来，基于合成生物学构建的工程菌治疗技术因其具有主动肿瘤归巢、微环境感知以及局部递送治疗载荷等优势，在肿瘤精准治疗领域受到广泛关注。特别是工程化益生菌可利用实体瘤内部低氧、免疫抑制及代谢异常等特征，选择性富集于肿瘤组织，并在局部表达治疗性物质，从而降低全身毒副作用。

2、然而，工程菌在临床转化过程中仍面临若干关键问题。首先，工程菌在体内的肿瘤富集并不等同于治疗活性的肿瘤特异性表达。现有多数工程菌系统主要依赖组成型表达或单一肿瘤微环境信号（如缺氧、酸性或乳酸）控制治疗蛋白表达，容易因细菌在外周组织短暂分布而产生非肿瘤组织中的异常表达，存在脱靶风险。其次，现有系统通常采用野生型菌株作为底盘，细菌内源蛋白酶对外源治疗蛋白存在降解作用，导致治疗载荷表达量低、胞外积累不足，影响治疗效果。此外，大多数研究仅在单一小鼠来源肿瘤模型中进行验证，缺乏在患者来源肿瘤模型中的多维度功能评估。

3、chien tiffany等人报道了一种增强工程菌肿瘤趋向性的策略，其通过构建能够感知氧气、ph值或乳酸等环境信号的基因线路，并调控细菌必需基因表达，实现细菌生长与肿瘤微环境信号之间的耦联（enhancing the tropism of bacteria via geneticallyprogrammed biosensors）。研究表明，经ph或氧传感器改造的细菌可在相应环境下优先生长；同时，在携带皮下肿瘤的小鼠模型中，将缺氧传感器和乳酸传感器通过and逻辑门连接后，可提高细菌在肿瘤组织中的富集特异性。

4、然而，上述技术主要利用缺氧、乳酸或ph信号实现对细菌生长的限制，其调控对象主要为细菌生存状态，而非治疗载荷表达过程，存在以下不足：

5、（1）其响应信号仍主要局限于单信号或缺氧-乳酸双信号组合，未进一步结合细菌自身群体状态信息，难以同时反映肿瘤代谢特征和局部细菌定植程度，因此难以精确界定治疗蛋白激活的适宜条件；

6、（2）由于仅依赖肿瘤微环境因素进行调控，当细菌扩散至非肿瘤组织但局部仍存在相似代谢特征时，仍可能出现渗漏表达或非特异性激活，导致肿瘤外组织中的治疗活性异常启动；

7、（3）其未对工程菌底盘进行蛋白稳定性优化，外源治疗蛋白仍可能受到宿主菌内源蛋白酶降解作用影响，难以实现高水平胞外积累；

8、（4）其验证体系主要基于传统小鼠肿瘤模型，缺少患者来源肿瘤模型的验证，难以充分评价不同肿瘤微环境中的治疗适用性和稳定性。

9、因此，如何构建一种同时响应肿瘤代谢状态和细菌群体密度的多输入逻辑调控系统，实现治疗蛋白在肿瘤微环境中的精准激活，同时提高外源蛋白稳定性并增强治疗输出效率，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种双响应乳酸和n-酰基高丝氨酸内酯的系统及其构建方法和应用。本发明构建了乳酸响应与群体感应相结合的双信号“与门”限制调控表达系统，实现对肿瘤微环境的特异性识别与精准表达控制，以大肠杆菌nissle 1917为底盘，通过敲除lon和ompt基因构建蛋白高表达的工程菌，并以该菌为底盘菌株展示双信号“与门”限制调控表达系统的应用。基于该系统，工程菌可在肿瘤部位借助自发光系统实现体内可视化监测，表达肿瘤杀伤蛋白，实现高效定植、可控表达与安全治疗。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、第一方面，一种乳酸响应表达系统，所述乳酸响应表达系统包括：

4、（1）乳酸阻遏子lldr的编码序列；

5、（2）组成型启动子，位于lldr编码序列上游并可操作地连接，用于控制lldr表达；

6、（3）效应基因的编码序列，所述效应基因为mcherry 荧光蛋白基因、luxcdabe基因、治疗性蛋白编码基因中至少一种；

7、（4）乳酸诱导型启动子plldr，位于效应基因编码序列上游并可操作地连接，用于控制效应基因表达，且plldr受 lldr 蛋白阻遏调控；

8、（5）载体骨架psc101低拷贝质粒；

9、其中，lldr表达盒与效应基因表达盒共同位于psc101载体骨架上。

10、作为本发明的一个实施方案，所述乳酸阻遏子lldr来自大肠杆菌ecn或top10。

11、作为本发明的一个实施方案，所述乳酸诱导型启动子plldr来自大肠杆菌ecn、k822（top10）、apg或plldr(tal)。

12、作为本发明的一个实施方案，所述组成型启动子为启动子j23106、启动子p9或启动子j23100。

13、作为本发明的一个实施方案，所述乳酸响应表达系统为psc101-j23100-lldr(ecn)-plldr(ecn)-mcherry（ecn-ecnj23100）、psc101-j23100-lldr(ecn)-plldr(k822)-mcherry（ecn-k822j23100）、psc101-j23100-lldr(ecn)-plldr(apg)-mcherry（ecn-apgj23100），或 psc101-j23100-lldr(ecn)-plldr(plldr(tal))-mcherry（ecn-plldr(tal)j23100）。

14、作为本发明的一个实施方案，质粒ecn-apgj23100的构建包括如下步骤：

15、s1、使用同源重组将psc101骨架片段、b0034-lldr (ecn)片段、plldr (ecn)片段、mcherry片段和lamda t0 teminator片段通过同源重组按顺序连接，转化，测序验证正确，获得质粒ecn-ecnj23106；

16、psc101骨架片段序列如seq id no.66所示，含有启动子j23106同源臂的b0034-lldr (ecn)片段序列如seq id no.67所示，含有另一部分启动子j23106同源臂的plldr(ecn)片段序列如seq id no.68所示，mcherry片段序列如seq id no.69所示，lamda t0teminator片段序列如seq id no.70所示；

17、s2、将序列如seq id no.72所述的含有同源臂的part:bba_k4244000片段，与使用序列如seq id no.50、51所示的引物对puc-plldr-r1/puc-mcherry-f1扩增质粒ecn-ecnj23106得到的片段同源重组，转化和测序后得到中间质粒；

18、s3、使用序列如seq id no.52、53所示的引物对puc-plldr-f2/puc-plldr-r2对所述中间质粒进行环状pcr后，同源重组，转化和测序得到质粒ecn-apg；

19、s4、使用序列如seq id no.61、64所示的引物对lldr-j23100-r1/lldr-j23100-f2对质粒ecn-apg进行环状pcr后，同源重组并转化测序，得到质粒ecn-apgj23100。

20、作为本发明的一个实施方案，质粒ecn-ecnj23100的构建包括如下步骤：

21、s1、使用同源重组将psc101骨架片段、b0034-lldr (ecn)片段、plldr (ecn)片段、mcherry片段和lamda t0 teminator片段通过同源重组按顺序连接，转化，测序验证正确，获得质粒ecn-ecnj23106；

22、psc101骨架片段序列如seq id no.66所示，含有启动子j23106同源臂的b0034-lldr (ecn)片段序列如seq id no.67所示，含有另一部分启动子j23106同源臂的plldr(ecn)片段序列如seq id no.68所示，mcherry片段序列如seq id no.69所示，lamda t0teminator片段序列如seq id no.70所示；

23、s2、使用序列如seq id no.61、62所示的引物对lldr-j23100-r1/lldr-j23100-f1对ecn-ecnj23106进行环状pcr后，同源重组并转化测序，得到质粒ecn-ecnj23100。

24、作为本发明的一个实施方案，质粒ecn-k822j23100的构建包括如下步骤：

25、s1、将序列如seq id no.71所述的含有同源臂的plldrk822片段，与使用序列如seqid no.47、38所示的引物对psc101-top10-mcherry-f1/j23106-lldr-r1扩增质粒ecn-ecnj23106得到的片段同源重组，转化和测序后得到质粒ecn-k822j23106；

26、s2、使用序列如seq id no.61、63所示的引物对lldr-j23100-r1/lldr-j23100-f3对质粒ecn-k822j23106进行环状pcr后，同源重组并转化测序，得到质粒ecn-k822j23100。

27、作为本发明的一个实施方案，质粒ecn-plldr(tal)j23100的构建包括如下步骤：

28、s1、使用序列如seq id no.38、54所示的引物对j23106-lldr-r1/tal-mcherry-f1线性化质粒ecn-ecnj23106后同源重组，转化和测序得到中间质粒1；

29、s2、对所述中间质粒1使用序列如seq id no.55、56所示的引物对tal-mcherry-f2/tal-mcherry-r1线性化，转化和测序得到中间质粒2；

30、s3、对所述中间质粒2使用序列如seq id no.57、58所示的引物对tal-mcherry-f3/tal-mcherry-r2线性化，转化和测序得到质粒ecn-plldr(tal)j23106；

31、s4、使用序列如seq id no.61、65所示的引物对lldr-j23100-r1/lldr-j23100-f4对质粒ecn-plldr(tal)j23106进行环状pcr，同源重组并转化测序后得到质粒ecn-plldr(tal)j23100。

32、作为本发明的一个实施方案，所述表达系统适用于原核微生物宿主或真核微生物宿主。所述原核微生物宿主包括大肠杆菌、益生芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌。所述真核微生物宿主包括酵母菌。

33、第二方面，本发明还提供一种乳酸和ahl双响应表达系统，所述双响应表达系统包括：

34、(1) 乳酸响应模块，所述乳酸响应模块包含乳酸阻遏子基因lldr、驱动lldr 组成型表达的组成型启动子、以及嵌入了正交的pecf20启动子的受lldr蛋白调控的（来自apg的）乳酸诱导型启动子plldr(pecf20)；

35、(2) ahl介导的群体感应模块luxr/luxi/pluxi；

36、(3) ecf20/pecf20调控模块介导的与门逻辑单元；

37、(4)效应基因，所述效应基因为报告基因mcherry、luxcdabe基因、治疗性蛋白编码基因中至少一种；

38、(5) 载体骨架，所述载体骨架为含有psc101复制子的低拷贝质粒；

39、其中，所述组成型启动子位于lldr基因上游并可操作地连接；所述乳酸诱导型启动子plldr位于效应基因上游并可操作地连接；

40、所述乳酸响应模块输出乳酸信号，所述群体感应模块输出 ahl 信号，所述与门逻辑单元同时接收乳酸信号与ahl信号，并协同

plldr共同调控效应基因的表达；

41、所述乳酸响应模块、群体感应模块、ecf20/pecf20调控模块及效应基因均位于psc101载体骨架上。

42、作为本发明的一个实施方案，所述乳酸阻遏子lldr来自大肠杆菌ecn。

43、作为本发明的一个实施方案，所述乳酸诱导型启动子plldr来自大肠杆菌ecn、k822、 apg或plldr(tal)。

44、作为本发明的一个实施方案，所述组成型启动子为启动子j23100。

45、作为本发明的一个实施方案，所述治疗性蛋白包括hlye、azurin、flagellin b、theta toxin中至少一种。

46、作为本发明的一个实施方案，所述乳酸和ahl双响应表达系统适用于原核微生物宿主或真核微生物宿主。所述原核微生物宿主包括大肠杆菌、益生芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌；所述真核微生物宿主包括酵母菌。

47、作为本发明的一个实施方案，提高所述双响应表达系统中luxi 基因的拷贝数，构建得到优化后的双响应表达系统。优选增加luxi基因表达的两个拷贝。

48、作为本发明的一个实施方案，所述双响应表达系统为psc101-lldr(ecn)-plldr(ecn-pecf20)-mcherry-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20（ecn-ecn-mluxr4b3）、psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-mcherry-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20（ecn-apg-mluxr4b3）、psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-mcherry-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20-j23100-luxi（ecn-apg-mtluxr4b3）或psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-luxcdabe-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20-j23100-luxi；所述ecn-apg-mtluxr4b3为在ecn-apg-mluxr4b3中增加luxi基因表达的两个拷贝构建而得。

49、作为本发明的一个实施方案，ecn-ecn-mluxr4b3的构建包括如下步骤：

50、a1、以质粒ecn-ecnj23100为模板，使用序列如seq id no.74、75所示的引物对psc101-gate-f1/pecf20-r1扩增获得基于psc101骨架的j23100-b0034-lldr(ecn)片段；

51、a2、使用同源重组体系顺序连接序列如seq id no.99所示的t7 terminator-luxr(4b3)-pluxr-pluxi-luxi-b1010片段、序列如seq id no.98所示的含有pluxi同源臂的ecf20-rrnb t1 terminator片段、所述基于psc101骨架的j23100-b0034-lldr(ecn)以及pecf20(ecn)-mcherry片段，转化及测序验证后得到质粒ecn-ecn-mluxr4b3；

52、所述pecf20(ecn)-mcherry片段中pecf20(ecn)表示在序列如seq id no.68所示的plldr (ecn) 中用seq id no.96所示的pecf20表达元件代替原有的-35至-10区的seqid no.97所示的p11表达元件。

53、作为本发明的一个实施方案，ecn-apg-mluxr4b3的构建包括如下步骤：

54、a1、以质粒ecn-ecnj23100为模板，使用序列如seq id no.74、75所示的引物对psc101-gate-f1/pecf20-r1扩增获得基于psc101骨架的j23100-b0034-lldr(ecn)片段；

55、a2、使用同源重组体系顺序连接序列如seq id no.99所示的t7 terminator-luxr(4b3)-pluxr-pluxi-luxi-b1010片段、序列如seq id no.98所示的含有pluxi同源臂的ecf20-rrnb t1 terminator片段、所述基于psc101骨架的j23100-b0034-lldr(ecn)以及pecf20(ecn)-mcherry片段，转化及测序验证后得到质粒ecn-ecn-mluxr4b3；

56、所述pecf20(ecn)-mcherry片段中pecf20(ecn)表示在序列如seq id no.68所示的plldr (ecn) 中用seq id no.96所示的pecf20表达元件代替原有的-35至-10区的seqid no.97所示的p11表达元件；

57、a3、使用序列如seq id no.51、61所示的引物对puc-mcherry-f1/lldr-j23100-r1扩增质粒ecn-ecn-mluxr4b3，得到构建需要的骨架片段b1；

58、a4、使用同源重组体系顺序连接骨架片段b1、seq id no.100所示的片段plldr(apg)-pecf20-1、seq id no.101所示的片段plldr (apg)-pecf20-2，转化及测序验证后得到质粒ecn-apg-mluxr4b3。

59、作为本发明的一个实施方案，ecn-apg-mtluxr4b3的构建包括如下步骤：

60、b1、以质粒ecn-apg-mluxr4b3为模板，使用序列如seq id no.88、89所示的引物对luxi-copy-r1/j23100-luxi-f2扩增得到片段b；

61、b2、使用同源重组体系将所述片段b、seq id no.106所示的j23100-b0034-luxi-b1010片段-1和seq id no.107所示的j23100-b0034-luxi-b1010片段-2顺序连接，转化及测序后得到质粒ecn-apg-mtluxr4b3。

62、作为本发明的一个实施方案，psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-luxcdabe-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20-j23100-luxi是将质粒ecn-apg-mtluxr4b3上的mcherry替换为基因luxcdabe构建而得。具体构建包括如下步骤：

63、c1、以质粒ecn-apg-mluxr4b3为模板，使用序列如seq id no.93、94所示的引物对luxcdabe-f2/puc-mcherry-r1扩增得到片段c；

64、c2、使用同源重组体系将所述片段c、seq id no.108所示的luxcdabe序列顺序连接，转化及测序后得到所述质粒psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-luxcdabe-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20-j23100-luxi。

65、第三方面，本发明还提供一种双响应乳酸和ahl表达治疗蛋白的系统psc101-ecn-apg-luxr4b3-mcherry-azurin-j23100-luxi；所述系统包括 psc101 载体骨架、乳酸响应模块、ahl 群体感应模块、ecf20/pecf20调控模块介导的与门逻辑单元和治疗蛋白基因azurin；

66、所述乳酸响应模块包含来自大肠杆菌ecn的乳酸阻遏子基因lldr、驱动lldr 组成型表达的组成型启动子j23100、以及嵌入了正交的pecf20启动子的受lldr蛋白调控的来自apg的乳酸诱导型启动子plldr(pecf20)；j23100位于lldr编码序列上游并可操作地连接，乳酸诱导型启动子plldr位于azurin编码序列上游并可操作地连接；正交的pecf20启动子启动表达所需要的σ因子ecf20置于ahl群体感应模块的控制下；

67、所述系统能够在乳酸与 ahl 双信号同时存在时激活 azurin 的表达。

68、作为本发明的一个实施方案，所述双响应乳酸和ahl表达治疗蛋白的系统是将质粒psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-luxcdabe-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20-j23100-luxi中的luxcdabe序列通过同源重组替换为优选的肿瘤治疗蛋白azurin的编码序列。

69、第四方面，本发明还提供一种基因工程菌，所述基因工程菌为在大肠杆菌ecn中转入前述的乳酸响应表达系统，或转入前述的双响应表达系统，或转入前述的双响应乳酸和ahl表达治疗蛋白的系统构建而得。优选转入双响应表达系统psc101-lldr(ecn)-plldr(apg-pecf20)-luxcdabe-luxr4b3-luxi-(pluxi)ecf20-j23100-luxi。更优选转入双响应乳酸和ahl表达治疗蛋白的系统psc101-ecn-apg-luxr4b3-mcherry-azurin-j23100-luxi。构建得到的基因工程菌能够在肿瘤微环境中定植并特异性表达治疗蛋白。

70、作为本发明的一个实施方案，所述大肠杆菌ecn为δlonδompt双敲除的大肠杆菌ecn。

71、作为本发明的一个实施方案，所述δlonδompt双敲除的大肠杆菌nissle 1917（

lon

ompt ecn）的构建包括如下步骤：

72、d1、选择ecn基因组中靶向lon的n20序列，设计引物；以pecgrna为模板扩增得到构建质粒pecgrna-lon-sgrna需要的片段pecgrna-lon-1、pecgrna-lon-2；

73、根据ecn基因组中的lon基因上下游（500bp）序列设计引物；以ecn作为模板，通过pcr扩增得到敲除lon基因需要的同源模板片段lon-h1和lon-h2；

74、通过同源重组体系将片段pecgrna-lon-1, lon-h1, lon-h2, pecgrna-lon-2通过同源臂顺序连接，热激转化大肠杆菌dh5a，测序验证正确后提取质粒，获得质粒pecgrna-lon-sgrna；

75、d2、选择ecn基因组中靶向ompt的n20序列，设计引物；以pecgrna为模板扩增得到构建质粒pecgrna-ompt-sgrna需要的片段pecgrna-ompt-1、pecgrna-ompt-2；

76、根据ecn基因组中的ompt基因上下游（500bp）序列设计引物；以ecn作为模板，通过pcr扩增得到敲除ompt基因需要的同源模板片段ompt-h1和ompt-h2；

77、通过同源重组体系将片段pecgrna-ompt-1, ompt-h1, ompt-h2, pecgrna-ompt-2通过同源臂顺序连接，热激转化大肠杆菌dh5a，测序验证正确后提取质粒，获得质粒pecgrna-ompt-sgrna；

78、d3、将质粒 pecgrna-lon-sgrna转入ecn-peccas电转感受态细胞，经电转培养后挑取单克隆进行鉴定；筛选并测序验证lon基因敲除正确的ecn菌株，经鼠李糖与卡那霉素筛选，获得消除pecgrna-lon-sgrna质粒、且保留peccas质粒的lon基因敲除菌株，记为δlon ecn-peccas；

79、d4、将质粒 pecgrna-ompt-sgrna 转入 δlon ecn-peccas 电转感受态细胞，经电转培养后挑取单克隆，进行 ompt 基因敲除的菌落 pcr 鉴定；对测序验证敲除正确的菌株进行筛选，消除 pecgrna-ompt-sgrna 质粒，获得菌株记为 δlonδompt ecn-peccas；

80、d5、将 δlonδompt ecn-peccas 接种培养，筛选获得卡那霉素敏感菌株，即为已消除 peccas 质粒、且完成 lon 和 ompt 双基因敲除的 ecn 菌株，记为 δlonδomptecn。

81、第五方面，前述任一双响应表达系统，或前述双响应乳酸和ahl表达治疗蛋白的系统，或前述基因工程菌在肿瘤部位借助自发光系统实现体内可视化监测或制备肿瘤治疗制剂中的应用均属于本发明的保护范围。

82、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

83、（1）通过构建δlonδompt底盘菌，解决了治疗蛋白表达和分泌效率不足的问题；

84、（2）通过构建乳酸与ahl双响应逻辑门，解决了现有工程菌体内表达缺乏肿瘤特异性的问题；

85、（3）通过引入luxcdabe与azurin模块，实现了体内可视化追踪和精准治疗；

86、（4）通过ct26及pdox模型验证，证明该系统具有肿瘤定植、正常组织快速清除、安全性较高和治疗效果显著等特点。