一种TNF启动子驱动的炎症响应报告细胞系及其应用

本发明属于细胞模型，具体涉及一种tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系及其应用。

背景技术：

1、tnf（tnf-α）是经典促炎细胞因子，参与nf-κb、mapk、tlr相关炎症网络和免疫微环境调控。tnf表达或tnf启动子活性变化可反映单核/巨噬细胞对细菌组分、炎症刺激、候选药物、天然产物、有机锡/有机磷酸酯等环境相关化合物及其他外源因素的炎症响应。目前，评价tnf相关炎症响应常用qpcr、elisa、western blot、流式细胞术或多因子检测等方法。这些方法能够检测mrna或蛋白水平，但多为终点检测，操作步骤较多，样本消耗较大，难以在同一检测体系中快速比较大量候选药物或活性成分对tnf启动子活性的调节作用。

2、thp-1细胞是常用的人源单核细胞模型，可用于研究单核细胞及巨噬细胞相关炎症反应。若能在thp-1细胞内建立tnf启动子驱动的分泌型报告系统，即可通过检测培养上清中的gluc发光信号，快速评价tnf启动子的激活、抑制及药物干预效果。抗炎药物、天然产物、中药活性成分、化合物库、通路抑制剂以及有机锡、有机磷酸酯等环境相关化合物评价通常需要可高通量、低样本消耗、可归一化比较的细胞报告系统。现有检测体系较难兼顾tnf启动子层面的实时响应、上清无创读数、阳性刺激验证、污染物相关化学物评价和大规模药物库初筛。

3、综上，现有技术中关于细胞检测技术仍存在如下缺陷：（1）tnf检测多依赖终点mrna或蛋白检测，不利于快速、批量化评价候选药物对tnf转录活性的调控作用；（2）缺少一种可用上清发光值直接读出的tnf启动子报告thp-1细胞模型，难以在不裂解细胞的情况下连续或平行比较多个处理条件；（3）现有方法常以单一阳性刺激或单一终点为主，缺乏面向抗炎活性物质高通量筛选、候选命中物复筛和炎症通路调控分析的一体化方法；（4）药物库筛选得到的大量化合物响应值需要与tnf启动子报告系统相结合，才能更直接地提出低tnf响应候选物、剂量-反应复筛和细胞活性并行验证流程。

技术实现思路

1、为解决现有技术中缺少一种可快速、无创、高通量评价tnf启动子炎症响应的细胞模型，以及缺少利用该模型进行抗炎药物或活性成分筛选、候选物初筛复筛和炎症通路调控分析的方法的问题，本发明的主要目的是提供一种tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系，将人tnf启动子片段置于分泌型gaussia荧光素酶（gluc）报告基因上游，并构建至含嘌呤霉素筛选标记的慢病毒报告载体中，经慢病毒包装后转导thp-1细胞，通过抗性筛选获得利用人tnf启动子驱动分泌型gaussia荧光素酶表达的thp-1稳定报告细胞系。

2、本发明的另一目的是提供所述tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系在tnf炎症通路响应检测、抗炎药物或活性成分筛选、候选化合物初筛复筛、有机锡/有机磷酸酯等环境相关化合物评价、阳性炎症刺激评价和上游信号通路调控分析中的应用。

3、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

4、本发明的第一方面，提供一种tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系，其为人单核细胞稳转细胞thp-1-tnf-gluc，所述人单核细胞稳转细胞thp-1-tnf-gluc的生物学分类为homo sapiens，保藏编号为cctcc no：c2026146，保藏日期为2026年6月24日。

5、本发明的第二方面，提供所述tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

6、（1）人tnf启动子片段置于分泌型gaussia荧光素酶报告基因上游，获得tnf启动子-gluc慢病毒报告载体；

7、（2）将tnf启动子-gluc慢病毒报告载体与慢病毒表达载体共同转染hek293t细胞，制备tnf启动子-gluc重组慢病毒；

8、（3）所述tnf启动子-gluc重组慢病毒转导thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得thp-1-tnf-gluc报告细胞，即为tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系。

9、作为优选，步骤（1）中，所述tnf启动子-gluc慢病毒报告载体采用hprm30556-lvpg04，基因登录号nm_000594，基因组位置为chr6+:31574249-31575728，tss=31575567（hg38），tnf启动子片段的序列如seq id no：1所示，长度为1480 bp，其中转录起始位点上游1318 bp、下游161 bp。

10、作为优选，步骤（2）中，所述慢病毒表达载体为pezx-lvpg04，细菌抗性为ampicillin，稳定筛选标记为puromycin，报告基因为gluc，载体另含分泌型碱性磷酸酶（seap）报告元件。

11、作为优选，步骤（2）中，所述tnf启动子-gluc重组慢病毒即tnf_hprm30556-lvpg04全质粒，其序列如seq id no:2所示，大小为10890 bp。

12、本发明的第二方面，还提供所述tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系在tnf炎症通路响应检测、抗炎药物或活性成分筛选、候选化合物初筛复筛、有机锡/有机磷酸酯等环境相关化合物评价、阳性炎症刺激评价和上游信号通路调控分析中的应用。

13、本发明的第三方面，还提供一种tnf启动子响应检测方法，包括：所述tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系接种于96孔板，设置空白、阴性对照、阳性炎症刺激组、候选药物或活性成分组，以及阳性刺激与候选物联合处理组；处理16-24小时后取培养上清，加入gluc检测试剂并读取发光值，扣除空白背景后按空白对照或阳性刺激对照进行归一化，获得tnf启动子相对响应值。

14、作为优选，所述阳性炎症刺激采用lps、il-1β、tnf-α、poly(i:c)、细菌组分中的一种或多种。

15、作为更优选，所述阳性炎症刺激采用lps，采用浓度为10-1000 ng/ml处理16-24小时。

16、本发明的第四方面，进一步提供一种抗炎活性物质筛选和环境相关化合物评价方法，包括：将候选药物、天然产物、中药活性成分、化合物库、通路抑制剂、有机锡化合物、有机磷酸酯类化合物加入所述tnf启动子驱动的炎症响应报告细胞系，在存在或不存在阳性炎症刺激的条件下检测上清gluc信号；低于阳性刺激对照或低于预设阈值的tnf-α归一化响应值用作提出抑制tnf启动子活性的候选物，高于阳性刺激对照或低于预设阈值的tnf-α归一化响应值用作提出激活tnf启动子或影响检测体系的候选物。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、（1）采用分泌型gluc作为报告基因，可直接检测细胞培养上清，减少细胞裂解操作，利于无创、快速和批量化检测。

19、（2）以tnf启动子活性作为读数，能够比单纯细胞活性检测更直接地反映候选物对tnf炎症转录响应的调节作用。

20、（3）thp-1-tnf-gluc报告细胞在不同细胞状态下均可对lps阳性刺激产生可量化响应，适合用于设置阳性刺激对照并确认检测条件。

21、（4）有机锡化合物和有机磷酸酯类化合物验证数据表明，该模型不仅可用于药物筛选，也可评价环境相关化合物对tnf启动子报告响应的影响。

22、（5）方法适配96孔板、酶标仪和候选化合物库筛选，可用于合并分析多来源候选化合物在lps刺激背景下对tnf报告信号的影响。

23、（6）低tnf-α响应候选物可进一步进入复筛、剂量-反应和细胞活性并行验证，便于从初筛结果中获得具有抗炎潜力或tnf通路调控作用的候选化合物。