在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量的制作方法

背景技术：

1、高等真核生物的基因组包含经修饰的5-甲基胞嘧啶核苷（5-mec）。该修饰通常作为二核苷cpg的部分存在，在二核苷cpg中，胞嘧啶在反应中被转化为5-甲基胞嘧啶，所述反应涉及将靶胞嘧啶翻转到完整的双螺旋之外并通过甲基转移酶从s-腺苷甲硫氨酸转移甲基（参见，例如klimasauskas等人 (1994) cell 76: 357-369）。这种酶促转化是已知存在于脊椎动物中的主要的dna表观遗传修饰并且对于正常胚胎发育而言是必需的（参见，例如bird (1992)

cell 70: 5-8；laird和jaenisch (1994)

human mol. genet. 3: 1487-1495；以及li等人 (1992) cell 69: 915-926）。

2、在真核细胞中，dna甲基化调节正常的细胞进程，例如基因组印迹、染色体不稳定性和x染色体失活。通常，dna甲基化发生在基因启动子中或邻近基因启动子的双核苷酸5’-cpg-3’位点（称为cpg岛或岸）处胞嘧啶的第五位碳上。甲基化通过下调转录（通过直接抑制转录机制或间接通过招募染色质重塑蛋白）来控制基因表达。染色体甲基化模式在胚胎发育期间发生动态变化，正确的甲基化模式必须始终在个体的终生保持。甲基化模式的变化与衰老有关，dna甲基化中的错误是肿瘤形成过程中发生的最早的变化之一。因此，基因启动子上甲基化的检测是重要的，尤其是对于诊断和/或监测癌症患者而言。

3、表观遗传改变（包括dna甲基化）中断了dna-rna-蛋白质轴（axis），其描述了遗传信息如何转录为信使rna（mrna）。基因组dna变异、mrna拷贝数和蛋白质水平之间的相关性可通过dna甲基化水平来描述。因此，dna甲基化水平和对应的下游mrna水平的共同测量对于理解表观遗传细胞调节的机制而言是重要的。

4、已开发了若干方法来有效且准确地检测和定量甲基化。最常用的技术是亚硫酸氢盐转化法，其将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。一旦被转化，可通过标准pcr技术、测序法等来确定dna甲基化特征（profile）。

5、存在若干适于亚硫酸氢盐转化和dna清除的dna甲基化试剂盒（例如来自zymoresearch的ez dna methylationtm试剂盒）。大多数试剂盒包括若干步骤、试剂和孵育次数，并且通常需要在转化前纯化dna，尽管一些试剂盒可利用组织或血浆/血清作为起始材料。

6、通常，亚硫酸氢盐转化方法需要至少4个步骤：1) dna变性；2)亚硫酸氢盐孵育；3)dna纯化；和4) 脱磺酸基。最后的脱磺酸基步骤可在柱上或溶液中完成，然后进行乙醇沉淀。目前没有甲基化试剂盒允许使用者一步完成全部过程——dna纯化、亚硫酸氢盐孵育、脱磺酸基、第二次dna纯化和甲基化特异性pcr。

技术实现思路

1、本文包括的各实施方案可包括但无需限于以下实施方案中的一种或多种：

2、本文包括的各实施方案可包括但无需限于以下实施方案中的一种或多种：

3、实施方案1：测定核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括：

4、i) 使包含核酸的生物样品与包含第一柱或滤器的第一基质材料接触，所述基质材料在第一柱或滤器处结合和/或过滤所述样品中的核酸，从而纯化dna。

5、ii) 从所述第一基质材料上洗脱结合的dna并使dna变性以产生洗脱的变性dna；

6、iii) 在亚硫酸氢盐试剂的存在下加热洗脱的dna以产生脱氨基的核酸；

7、iv) 使所述脱氨基的核酸与包含第二柱的第二基质材料接触以使所述脱氨基的核酸与所述第二基质材料结合；

8、v) 将结合的脱氨基的核酸脱磺酸基和/或通过将脱氨基的核酸与碱性溶液接触来将核酸同时洗脱和脱磺酸基以产生转化的（例如亚硫酸氢盐转化的）核酸；

9、vi) 从所述第二基质材料上洗脱所述亚硫酸氢盐转化的核酸；和

10、vii) 在所述转化的核酸上进行甲基化特异性pcr和/或核酸测序和/或高分辨率熔解分析（hrm）以测定所述核酸的甲基化，其中至少步骤iv)至vi)在单个反应盒中进行。

11、实施方案2：实施方案1的方法，其中至少步骤iv)至vi)在单个反应盒中进行。

12、实施方案3：实施方案1的方法，其中至少步骤iii)至vi)在单个反应盒中进行。

13、实施方案4：实施方案1的方法，其中至少步骤ii)至vi)在单个反应盒中进行。

14、实施方案5：实施方案1的方法，其中至少步骤i)至vi)在单个反应盒中进行。

15、实施方案6：实施方案1-5中任一项的方法，其中步骤vii)在相同的反应盒中进行。

16、实施方案7：实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一基质材料和所述第二基质材料是形成相同柱的相同材料。

17、实施方案8：实施方案1-7中任一项的方法，其中所述第一基质材料和所述第二基质材料形成不同的柱。

18、实施方案9：实施方案1-8中任一项的方法，其中当进行所述甲基化特异性pcr时，是在所述盒中进行。

19、实施方案10：实施方案1-9中任一项的方法，其中当进行所述核酸测序时，是在所述盒中或在与所述盒偶联的装置中进行。

20、实施方案11：实施方案1-10中任一项的方法，其中所述盒包括含有所述第一基质材料的柱、样品接收室、温度控制的通道或室、多个包含试剂和/或缓冲液的室，并且在使用时所述室中至少一个包含脱磺酸基/洗脱缓冲液，并且其中所述盒任选地包括含有所述第二基质材料的第二柱。

21、实施方案12：实施方案11的方法，其中在使用时所述室中至少一个包含提供亚硫酸氢盐离子的试剂。

22、实施方案13：实施方案11-12中任一项的方法，其中所述第二柱不存在。

23、实施方案14：实施方案11-13中任一项的方法，其中所述第二柱存在。

24、实施方案15：实施方案11-14中任一项的方法，其中所述盒除所述温度控制的通道或室以外还包括热循环通道或室。

25、实施方案16：实施方案11-14中任一项的方法，其中所述温度控制的通道或室是热循环通道或室。

26、实施方案17：实施方案11-16中任一项的方法，其中所述盒包括含有一种或多种试剂的一个或多个室，所述试剂选自甲基化特异性pcr引物、甲基化特异性pcr探针、pcr酶和pcr反应缓冲液。

27、实施方案18：实施方案17的方法，其中所述盒包括含有一种或多种引物和探针的一个或多个室，所述引物和探针用于检测亚硫酸氢盐转化的dna的正向链的甲基化。

28、实施方案19：实施方案17-18中任一项的方法，其中所述盒包括含有一种或多种引物和探针的一个或多个室，所述引物和探针用于检测亚硫酸氢盐转化的dna的反向链的甲基化。

29、实施方案20：实施方案11-19中任一项的方法，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室、和当存在时，所述温度控制的通道或室和/或热循环通道或室，选择性地处于流体连通中。

30、实施方案21：实施方案20的方法，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室、和当存在时，所述热循环通道或室，通过微流体通道和阀选择性地处于流体连通中。

31、实施方案22：实施方案20的方法，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室、和当存在时，所述热循环通道或室或进入所述热循环通道或室的端口（port），排列在中央阀的周围并且选择性地处于与所述中央阀中的通道的流体连通中，其中配置所述中央阀以适应柱塞，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室。

32、实施方案23：实施方案11-22中任一项的方法，其中所述盒在使用时包括：

33、包含样品的第一室；

34、包含硫氰酸胍-乙醇（gtc-etoh）溶液的第二室；

35、包含亚硫酸氢盐试剂的第三室；

36、包含缓冲液的第四室；

37、包含冲洗溶液的第五室；和

38、包含洗脱/脱磺酸基试剂的第六室。

39、实施方案24：实施方案23的方法，其中所述第一室包含gtc-etoh-tween萃取/沉淀试剂中的所述样品。

40、实施方案25：实施方案23-24中任一项的方法，其中在将所述样品放置在盒中时或接近将所述样品放置在盒中时添加gtc-etoh-tween缓冲液。

41、实施方案26：实施方案23-25中任一项的方法，其中在将所述样品放置在盒中时或接近将所述样品放置在盒中时添加亚硫酸氢盐试剂。

42、实施方案27：实施方案23的方法，其中将gtc-etoh-tween缓冲液作为所述盒的组分提供。

43、实施方案28：实施方案23-25中任一项的方法，其中将亚硫酸氢盐试剂作为所述盒的组分提供。

44、实施方案29：实施方案11-28中任一项的方法，其中所述盒包括含有pcr引物和/或探针和/或pcr酶的第七室。

45、实施方案30：实施方案11-29中任一项的方法，其中所述盒包括也含有pcr引物和/或探针和/或pcr酶的第八室。

46、实施方案31：实施方案29-30的方法，其中将所述pcr引物和/或探针和/或酶作为珠提供。

47、实施方案32：实施方案1-31中任一项的方法，其中所述生物样品包括一种或多种选自以下的样品：细胞、组织和含有核酸的生物液体。

48、实施方案33：实施方案32的方法，其中所述生物样品包括选自全血液、血浆、血清、唾液、粘液、尿、痰、胰液和脑脊髓液的生物液体。

49、实施方案34：实施方案32的方法，其中所述生物样品包括选自以下的样品：组织样品、福尔马林固定石蜡包埋的（ffpe）组织、新鲜冷冻组织、细针抽吸物（fna）和组织芯活检。

50、实施方案35：实施方案1-34中任一项的方法，其中所述方法包括使所述生物样品与裂解溶液接触。

51、实施方案36：实施方案35的方法，其中所述方法包括在所述样品接收室中提供所述样品并使所述样品与萃取/沉淀溶液接触。

52、实施方案37：实施方案1-36中任一项的方法，其中所述基质材料包括选自玻璃或二氧化硅、离子交换树脂、纤维素和羟基磷灰石的柱材料。

53、实施方案38：实施方案37的方法，其中所述基质材料包括玻璃。

54、实施方案39：实施方案1-38中任一项的方法，其中所述亚硫酸氢盐离子被提供为选自亚硫酸氢铵、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯和dabso的化合物。

55、实施方案40：实施方案39的方法，其中所述亚硫酸氢盐离子由亚硫酸氢铵提供。

56、实施方案41：实施方案1-40中任一项的方法，其中所述亚硫酸氢盐在试剂混合物中提供，所述试剂混合物包括防止亚硫酸盐氧化的清除剂和/或催化剂。

57、实施方案42：实施方案41的方法，其中所述亚硫酸氢盐在试剂混合物中提供，所述试剂混合物包括选自trolox和氢醌的清除剂。

58、实施方案43：实施方案41-42中任一项的方法，其中所述亚硫酸氢盐在试剂混合物中提供，所述试剂混合物包括作为催化剂的聚胺。

59、实施方案44：实施方案1-43中任一项的方法，其中所述洗脱结合的dna包括使用低浓度的氢氧化钾或其他碱洗脱并使所述dna变性。

60、实施方案45：实施方案44的方法，其中所述洗脱结合的dna包括使用ph大于约ph10.5的碱性溶液来洗脱并使所述dna变性。

61、实施方案46：实施方案44的方法，其中所述洗脱结合的dna包括使用ph大于约ph12的碱性溶液来洗脱并使所述dna变性。

62、实施方案47：实施方案45-46的方法，其中所述碱性溶液是10-15 mm koh溶液。

63、实施方案48：实施方案1-47中任一项的方法，其中所述用亚硫酸氢盐离子孵育洗脱的dna以产生脱氨基的核酸包括在浓度范围从约6 m至约7 m的亚硫酸氢铵溶液中孵育dna。

64、实施方案49：实施方案48的方法，其中所述用亚硫酸氢盐离子孵育洗脱的dna以产生脱氨基的核酸包括在浓度约6.5 m的亚硫酸氢铵溶液中孵育dna。

65、实施方案50：实施方案49的方法，其中所述孵育包括将浓缩的亚硫酸氢盐溶液中的dna转移到所述盒中的温度控制的通道或室并加热所述混合物。

66、实施方案51：实施方案50的方法，其中所述孵育包括从温度约60℃至约95℃热循环浓缩的亚硫酸氢盐溶液。

67、实施方案52：实施方案1-51中任一项的方法，其中所述使所述脱氨基的核酸与第二基质材料接触包括将dna-亚硫酸氢盐溶液与新鲜的gtc-etoh混合并将所述溶液分配到所述第二基质材料上。

68、实施方案53：实施方案52的方法，其中所述方法包括用新鲜的gtc-etoh、然后用冲洗溶液来洗涤所述第二基质材料中的dna。

69、实施方案54：实施方案53的方法，其中所述冲洗溶液包括peg200。

70、实施方案55：实施方案1-54中任一项的方法，其中所述将结合的脱氨基的核酸脱磺酸基包括使用高ph脱磺酸基缓冲液从所述第二柱洗脱dna和孵育所述溶液。

71、实施方案56：实施方案55的方法，其中所述孵育持续时间范围为约1分钟至约1小时，或约5分钟至约30分钟，或约10分钟至约20分钟，或约15分钟。

72、实施方案57：实施方案55-56的方法，其中所述高ph脱磺酸基/洗脱缓冲液包括koh。

73、实施方案58：实施方案55-57中任一项的方法，其中所述孵育是在之前盛放所述高ph脱磺酸基缓冲液的室（例如室10）中。

74、实施方案59：实施方案1-58中任一项的方法，其中在用亚硫酸氢盐离子孵育之后，用缓冲液洗涤温度控制的通道或室以除去残余的亚硫酸氢盐并中和ph。

75、实施方案60：实施方案1-59中任一项的方法，其中对所述亚硫酸氢盐转化的核酸进行高分辨率熔解分析（hrm）以测定所述核酸的甲基化。

76、实施方案61：实施方案1-60中任一项的方法，其中进行所述亚硫酸氢盐转化的核酸的核酸测序以测定所述核酸的甲基化。

77、实施方案62：实施方案1-60中任一项的方法，其中进行甲基化特异性pcr以测定靶核酸序列的甲基化。

78、实施方案63：实施方案62的方法，其中使用特异性针对甲基化序列的引物和/或特异性针对未甲基化序列的引物进行所述甲基化特异性pcr（msp）。

79、实施方案64：实施方案62的方法，其中所述甲基化特异性pcr包括methylight方案。

80、实施方案65：实施方案62的方法，其中使用特异性针对亚硫酸氢盐转化的甲基化序列和/或未甲基化序列的引物来进行taqman pcr反应。

81、实施方案66：实施方案62-65中任一项的方法，其中所述msp使用一种或多种为扩增的甲基化序列的标记物的荧光探针和/或一种或多种为扩增的未甲基化的序列的标记物的荧光探针。

82、实施方案67：实施方案66的方法，其中所述荧光探针包括荧光报告染料和淬灭剂染料，其中所述探针在经taq dna聚合酶的5’至3’核酸酶活性裂解时提供信号。

83、实施方案68：实施方案66-67中任一项的方法，其中通过分别特异性针对目的扩增区域中不同的甲基化区域的多个探针的组合信号来确定甲基化信号。

84、实施方案69：实施方案66-67中任一项的方法，其中通过特异性针对目的扩增区域中相同甲基化区域的多个探针来确定甲基化信号。

85、实施方案70：实施方案66-67中任一项的方法，其中所述多个探针包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个探针。

86、实施方案71：实施方案66-67中任一项的方法，其中通过目的扩增区域中的单一探针来确定甲基化信号。

87、实施方案72：实施方案66-71中任一项的方法，其中所述探针以单路或多路运行。

88、实施方案73：实施方案66-71中任一项的方法，其中所述探针以多路形式运行。

89、实施方案74：实施方案66-73中任一项的方法，其中所述探针作为巢式pcr反应运行。

90、实施方案75：实施方案66-74中任一项的方法，其中所述pcr反应包括亚硫酸氢盐污染对照探针，如果反应中存在亚硫酸氢盐，则在pcr过程中该探针经历亚硫酸氢盐介导的裂解。

91、实施方案76：实施方案1-75中任一项的方法，其中针对一种或多种突变基因进行pcr。

92、实施方案77：实施方案1-76中任一项的方法，其中针对作为对照的未转化的dna，进行pcr。

93、实施方案78：实施方案1-77中任一项的方法，其中针对作为对照的转化的dna，进行pcr。

94、实施方案79：实施方案77的方法，其中针对未转化的dna进行pcr，其中所述未转化的dna是所述方法的靶标。

95、实施方案80：实施方案1-79中任一项的方法，其中亚硫酸氢盐反应和pcr反应、或脱磺酸基反应和pcr反应，或亚硫酸氢盐反应、脱磺酸基反应和pcr反应全部在相同的反应管或室中进行。

96、实施方案81：实施方案1-80中任一项的方法，其中所述使包含核酸的生物样品与第一基质材料接触包括使含有rna的样品与所述第一基质材料接触，其中所述基质材料结合所述rna，从而纯化所述rna。

97、实施方案82：实施方案81的方法，其中所述方法包括从所述基质材料上洗脱所述rna，基本上独立于dna。

98、实施方案83：实施方案82的方法，其中使用tris缓冲洗脱从所述第一基质材料上洗脱rna。

99、实施方案84：权利要求81-83中任一项的方法，其中所述rna被洗脱并贮存在室中。

100、实施方案85：实施方案81-84中任一项的方法，其中在所述rna上进行逆转录（rt）并进行qrt-pcr以测定靶rna序列的水平。

101、实施方案86：实施方案82-85中任一项的方法，其中所述rna部分用于从所述第二基质材料上洗脱亚硫酸氢盐转化的核酸并与亚硫酸氢盐转化的dna混合，或与被洗脱的亚硫酸氢盐转化的dna混合。

102、实施方案87：实施方案86的方法，其中所述rna在与亚硫酸氢盐转化的dna结合之前或之后进行rt。

103、实施方案88：实施方案86-87中任一项的方法，其中针对混合物中的rt rna进行qrt-pcr以测定靶rna序列的水平，并对所述混合物进行甲基化特异性pcr以测定靶dna序列的甲基化。

104、实施方案89：实施方案1-88中任一项的方法，其中测定选自以下的基因的启动子区的甲基化：

mgmt. rassf1a、

adamts1、

bnc1、

hist1h3c、

hoxb4、

rasgrf2、

tm6sf1和

akr1b1。

105、实施方案90：实施方案81-89中任一项的方法，其中测定甲基转移酶的rna表达水平。

106、实施方案91：实施方案90的方法，其中测定选自dnmt1、dnmt2、dnmt3a、dnmt3b和tnmt3l的甲基转移酶的rna表达水平。

107、实施方案92：用于测定核酸的甲基化状态的盒，所述盒包括：包含第一基质材料的柱、样品接收室、温度控制的通道或室、多个包含试剂和/或缓冲液的室，在使用时至少一个所述室包含亚硫酸氢盐试剂，并且至少一个所述室包含脱磺酸基/洗脱缓冲液，并且其中所述盒任选地包括含有所述第二基质材料的第二柱。

108、实施方案93：实施方案92的盒，其中所述盒在使用时包括含有试剂的室，所述试剂包含硫氰酸胍乙醇（gtc-etoh）。

109、实施方案94：实施方案92-93中任一项的盒，其中不存在所述第二柱。

110、实施方案95：实施方案92-93中任一项的盒，其中存在所述第二柱。

111、实施方案96：实施方案92-95中任一项的盒，其中所述温度控制的通道或室是热循环通道或室。

112、实施方案97：实施方案92-96中任一项的盒，其中所述盒还包括第二加热通道或室。

113、实施方案98：实施方案92-97中任一项的盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包括选自亚硫酸氢铵、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯和dabso的化合物。

114、实施方案99：实施方案98的盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢铵。

115、实施方案100：实施方案92-99中任一项的盒，其中所述亚硫酸氢盐在试剂混合物中提供，所述试剂混合物包括防止亚硫酸盐氧化的清除剂和/或催化剂。

116、实施方案101：实施方案100的盒，其中所述亚硫酸氢盐在试剂混合物中提供，所述试剂混合物包括选自trolox和氢醌的清除剂。

117、实施方案102：实施方案100-101中任一项的和，其中所述亚硫酸氢盐在试剂混合物中提供，所述试剂混合物包括作为催化剂的聚胺。

118、实施方案103：实施方案92-102中任一项的盒，其中当存在所述第一基质材料和/或所述第二基质材料时，所述第一基质材料和/或所述第二基质材料包括选自玻璃或二氧化硅、离子交换树脂和羟基磷灰石的材料。

119、实施方案104：实施方案92-103中任一项的盒，其中所述盒包括一个或多个含有一种或多种试剂的室，所述试剂选自甲基化特异性pcr引物、甲基化特异性pcr探针、pcr酶和pcr反应缓冲液。

120、实施方案105：实施方案104的盒，其中所述盒包含至少两个室，所述室包含一种或多种选自甲基化特异性pcr引物、甲基化特异性pcr探针、pcr酶和pcr反应缓冲液的试剂。

121、实施方案106：实施方案92-105中任一项的盒，其中所述盒包含至少一个室，所述室包含用于检测转化的dna的正向链的甲基化的引物和探针。

122、实施方案107：实施方案92-106中任一项的盒，其中所述盒包含至少一个室，所述室包含用于检测转化的dna的反向链的甲基化的引物和探针。

123、实施方案108：实施方案104-107中任一项的盒，其中所述pcr引物和/或探针和/或酶作为珠提供。

124、实施方案109：实施方案92-108中任一项的盒，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室以及所述温度控制的加热通道或室选择性地处于流体连通中。

125、实施方案110：实施方案109的盒，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室，以及所述温度控制的通道或室通过微流体通道和阀选择性地处于流体连通中。

126、实施方案111：实施方案109的盒，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室，以及所述温度控制的通道或室或进入所述温度控制的通道或室的端口排列在中央阀的周围并且选择性地处于与所述中央阀中的通道的流体连通中，其中配置所述中央阀以适应柱塞，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室。

127、实施方案112：实施方案92-111中任一项的盒，其中配置所述盒从而在使用时所述盒包括：

128、包含样品的第一室；

129、包含硫氰酸胍-乙醇（gtc-etoh）溶液的第二室；

130、包含亚硫酸氢盐试剂的第三室；

131、包含缓冲液的第四室；

132、包含冲洗溶液的第五室；和

133、包含洗脱/脱磺酸基试剂的第六室。

134、实施方案113：实施方案112的盒，其中所述第一室包含gtc-etoh-tween萃取/沉淀试剂中的所述样品。

135、实施方案114：实施方案92-113中任一项的盒，其中在将所述样品放置在盒中时或接近将所述样品放置在盒中时配置所述盒以用于待被添加至所述盒的亚硫酸氢盐试剂。

136、实施方案115：实施方案92-113中任一项的盒，其中将亚硫酸氢盐试剂作为所述盒的组分提供。

137、实施方案116：实施方案92-115中任一项的盒，其中在将所述样品放置在盒中时或接近将所述样品放置在盒中时配置所述盒以用于添加gtc-etoh-tween缓冲液。

138、实施方案117：实施方案92-115中任一项的盒，其中将gtc-etoh-tween缓冲液作为所述盒的组分提供。

139、实施方案118：实施方案92-117中任一项的盒，其中所述盒包括含有pcr引物和/或探针和/或pcr酶的第七室。

140、实施方案119：实施方案92-118中任一项的盒，其中所述盒包括也含有pcr引物和/或探针和/或pcr酶的第八室。

141、实施方案120：实施方案92-119中任一项的盒，其中所述盒包括一个或多个室，所述室包含特异性针对亚硫酸氢盐转化的甲基化和/或未甲基化序列的引物。

142、实施方案121：实施方案92-120中任一项的盒，其中所述盒包括一个或多个含有taqman pcr反应试剂的室。

143、实施方案122：实施方案92-121中任一项的盒，其中所述盒包括一个或多个室，其含有一种或多种为扩增的甲基化序列标记物的荧光探针和/或一种或多种为扩增的未甲基化序列标记物的荧光探针。

144、实施方案123：实施方案122的盒，其中所述探针包括荧光报告染料和淬灭剂染料，其中所述探针在经taq dna聚合酶的5’至3’核酸酶活性裂解时提供信号。

145、实施方案124：实施方案122-123中任一项的盒，其中所述盒包括多个探针，所述探针分别特异性针对目的扩增区域中不同的甲基化区域。

146、实施方案125：实施方案122-123中任一项的盒，其中所述盒包括特异性针对目的扩增区域中的甲基化区域的单一探针。

147、实施方案126：实施方案122-123中任一项的盒，其中所述盒包括多个探针，所述探针分别特异性针对目的扩增区域中的相同甲基化区域。

148、实施方案127：实施方案92-126中任一项的盒，其中所述盒包含引物和/或探针以测定选自以下的基因的启动子区的甲基化：

mgmt、

rassf1a、

adamts1、

bnc1、

hist1h3c、

hoxb4、

rasgrf2、

tm6sf1和

akr1b1。

149、实施方案128：实施方案92-126中任一项的盒，其中所述盒包含一种或多种表5、9或10中所示的引物和/或一种或多种表5、9或10中所示的探针。

150、实施方案129：实施方案128的盒，其中所述盒包含以下用于使用巢式pcr反应来测定

mgmt甲基化的探针和引物：

151、外正向引物（248b），其包含核苷酸序列gtttt(t*)agaayg(t*)tttgygttt（seq idno:263）；

152、外反向引物（249b），其包含核苷酸序列：aaaaaac(t*)ccrcactcttcc（seq id no:265）；

153、内正向引物（250），其包含核苷酸序列tttcgacgttcgtaggttttcgc（seq id no:266）；

154、内反向引物（251），其包含核苷酸序列gcactcttccgaaaacgaaacg（seq id no:267）；和

155、探针（252a），其包含核苷酸序列：荧光团-ccaaacac(t*)caccaaatc(n*)caaac-阻断剂（seq id no: 268）。

156、实施方案130：实施方案128-129中任一项的盒，其中所述盒包含以下用于使用巢式pcr反应来测定actb（例如，作为对照）甲基化的探针和引物：

157、外正向引物（102），其包含核苷酸序列：gtgatggaggaggtttagtaagtt（seq id no:103）；

158、外反向引物（10），其包含核苷酸序列：ccaataaaacctactcctcccttaa（seq id no:104）；

159、内正向引物（148），其包含核苷酸序列：ggtttagtaagttttttggattgtg（seq id no:149）；

160、内反向引物（149），其包含核苷酸序列：ccttaaaaattacaaaaaccacaac（seq id no:150）；和

161、探针（178），其包含核苷酸序列：荧光团-ccaccacccaacaca(n*)caa(t*)aacaaacac-阻断剂（seq id no:179）。

162、实施方案131：实施方案92-130中任一项的盒，其中配置所述盒以用于测定甲基转移酶的rna表达水平。

163、实施方案132：实施方案131的盒，其中所述甲基转移酶选自dnmt1、dnmt2、dnmt3a、dnmt3b和tnmt3l。

164、实施方案133：用于测定生物样品中核酸的甲基化的系统，所述系统包括：被配置以包含一个或多个样品处理模块的附件（enclosure），各样品处理模块被配置以容纳可移动的实施方案92-132中任一项的盒；其中所述系统被配置以操作所述样品处理模块进行样品处理，来测定一种或多种靶核酸的甲基化并任选地测定相应的可移动样品盒内一种或多种靶dna序列的水平，其中所述对相应的可移动样品盒内的样品的处理实施实施方案1-91中任一项的方法。

165、实施方案134：实施方案133的系统，其中所述系统被配置以包含一个样品处理模块。

166、实施方案135：实施方案133的系统，其中所述系统被配置以包含至少两个样品处理模块，或至少4个样品处理模块，或至少8个样品处理模块，或至少12个样品处理模块，或至少16个样品处理模块，或至少20个样品处理模块，或至少24个样品处理模块，或至少28个样品处理模块，或至少32个样品处理模块，或至少64个样品处理模块，或至少128个样品处理模块。

167、实施方案136：实施方案133-135中任一项的系统，其中所述模块包括一个或多个加热板以加热所述盒中温度控制的室或通道。

168、实施方案137：实施方案133-136中任一项的系统，其中所述模块包括被配置来冷却所述盒中温度控制的通道或室的风扇。

169、实施方案138：实施方案133-137中任一项的系统，其中所述模块包括电路以将信息（例如光学信息）传递到计算机，用于分析。

170、实施方案139：实施方案133-138中任一项的系统，其中所述模块包括光学区块（block）以提供一种或多种所述盒中的反应产生的光学信号的激发和/或检测。

171、实施方案140：实施方案133-139中任一项的系统，其中所述系统被配置以操作所述盒进行实施方案1-91中任一项的方法。

172、实施方案141：实施方案133-139中任一项的系统，其中所述系统被配置以操作所述盒：将样品结合至柱；从所述柱洗脱dna并用转化试剂结合所述dna；在反应室或管中加热dna/转化试剂溶液以产生转化的dna；将转化的dna结合至柱；从柱脱磺酸基并洗脱dna；在反应室或管中对洗脱的脱磺酸基的dna进行pcr。

173、实施方案142：实施方案141的系统，其中所述pcr在相同的反应室或管中进行，在所述反应室或管中dna/转化试剂溶液被事先加热。

174、实施方案143：用于样品制备的盒，所述盒包括：包含结合dna的亲和基质的管道或室，排列在中央阀组件的周围并且选择性地处于与所述中央阀组件的流体连通中的多个室，其中配置所述中央阀组件以适应柱塞，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室，其中所述多个室包括：被配置以接收最高达约5 ml或最高达约4 ml的样品溶液；包含peg的室；包含gtc-etoh的室；包含碱性溶液的室；和包含缓冲液的室。

175、实施方案144：实施方案143的盒，其中所述多个室还包括含有亚硫酸氢盐试剂的室。

176、实施方案145：实施方案143-144中任一项的盒，其中所述多个室包括含有gtc-乙醇洗涤溶液的室。

177、实施方案146：实施方案145的盒，其中所述gtc-乙醇洗涤溶液包含1.25 m硫氰酸胍、25 mm tris ph 7.0和50%乙醇。

178、实施方案147：实施方案143-146中任一项的盒，其中所述peg包括peg200。

179、实施方案148：实施方案143-147中任一项的盒，其中所述碱性溶液包括koh。

180、实施方案149：实施方案143-148中任一项的盒，其中所述缓冲液包括tris。

181、实施方案150：实施方案143-149中任一项的盒，其中所述多个室包括含有珠的室，所述珠包含一种或多种pcr引物和/或探针。

182、实施方案151：实施方案143-150中任一项的盒，其中所述包含peg的室包含约1 mlpeg。

183、实施方案152：实施方案143-151中任一项的盒，其中所述包含碱性溶液的所述室包含约500 µl溶液。

184、实施方案153：实施方案143-152中任一项的盒，其中所述包含gtc-etoh的室包含约2 ml gtc-etoh。

185、实施方案154：实施方案143-153中任一项的盒，其中所述包含缓冲液的室包含约2ml缓冲液。

186、实施方案155：高容量样品制备（hvsp），所述盒包括：包含结合dna的亲和基质的通道或室，排列在中央阀组件的周围并且选择性地处于与所述中央阀组件的流体连通中的多个室，其中配置所述中央阀组件以适应柱塞，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室，其中所述多个室包括：至少两个不同的室，其分别被配置以接收最高达4.5 ml样品溶液；包含peg的室；包含碱性溶液的室；和包含缓冲液的室。

187、实施方案156：实施方案155的盒，其中所述多个室包括至少三个不同的室，其分别被配置以接收最高达4 ml样品溶液。

188、实施方案157：实施方案155-156中任一项的盒，其中所述peg包括peg200。

189、实施方案158：实施方案155-157中任一项的盒，其中所述碱性溶液包括koh。

190、实施方案159：实施方案155-158中任一项的盒，其中所述缓冲液包括tris。

191、实施方案160：实施方案155-159中任一项的盒，其中所述多个室包括含有洗涤溶液的室。

192、实施方案161：实施方案160的室，其中所述洗涤溶液包括1.25 m硫氰酸胍、25 mmtris ph 7.0和50%乙醇。

193、实施方案162：实施方案155-161中任一项的盒，其中所述盒包括被配置以去除经处理的样品的室。

194、实施方案163：实施方案155-162中任一项的盒，其中所述样品室在使用时包含样品溶液、gtc和异丙醇。

195、实施方案164：实施方案163的盒，其中所述样品室在使用时包含基本上等体积的样品溶液、gtc和异丙醇。

196、实施方案165：实施方案155-164中任一项的盒，其中所述盒在使用时包含4 ml样品溶液，该样品溶液被设置在各经配置以接收样品的所述室中。

197、实施方案166：实施方案155-165中任一项的盒，其中所述盒提供dna或rna回收，其基本上相对于0.5 ml至约4 ml样品的样品体积呈线性关系。

198、实施方案167：实施方案155-166中任一项的盒，其中所述盒包含或经配置以接收转化试剂。

199、实施方案168：实施方案167的盒，其中所述盒在使用时进行dna的亚硫酸盐转化。

200、实施方案169：用于从血清或血浆制备dna样品的裂解溶液，所述裂解溶液包括：gtc、缓冲液、洗涤剂和任选的消泡剂。

201、实施方案170：实施方案169的裂解溶液，其中所述用于血清或血浆的裂解溶液包括gtc、tris ph 7.0、tween 20和消泡剂se15。

202、实施方案171：实施方案170的裂解溶液，其中所述用于血清或血浆的裂解溶液包括约4.5 m gtc、约45 mm tris ph 7.0、约1% tween20和约0.01%消泡剂se15。

203、实施方案172：用于从ffpe样品制备dna样品的裂解溶液。

204、实施方案173：实施方案172的裂解溶液，其中所述用于ffpe样品的裂解溶液包括缓冲液、洗涤剂、nacl、mgcl2、螯合剂、消泡剂se15和叠氮化钠。

205、实施方案174：实施方案173的裂解溶液，其中所述用于ffpe样品的裂解溶液包括约1% tween20、约400 mm nacl、约25 mm edta、约10 mm mgcl2、约50 mm hepes ph 7.2、约0.01%消泡剂se15和约0.01%叠氮化钠。

206、实施方案175：用于测定dna甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括：包含实施方案92-136中任一项的用于测定核酸甲基化状态的盒的容器。

207、实施方案176：实施方案175的试剂盒，其中所述试剂盒还包括含有裂解溶液的容器。

208、实施方案177：实施方案176的试剂盒，其中所述裂解溶液是实施方案169-171中任一项的用于血清或血浆的裂解溶液。

209、实施方案178：实施方案176的试剂盒，其中所述裂解溶液是实施方案172-174中任一项的用于ffpe样品的裂解溶液。

210、实施方案179：实施方案175-178中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有蛋白酶k的容器。

211、实施方案180：实施方案175-179中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括所述盒中或与所述盒分开的容器中的转化试剂。

212、实施方案181：实施方案180的试剂盒，其中所述试剂盒包括与所述盒分开的容器中的所述转化试剂。

213、实施方案182：实施方案180的试剂盒，其中所述试剂盒包括在所述盒的室中提供的所述转化试剂。

214、实施方案183：实施方案180-182中任一项的试剂盒，其中所述转化试剂包括选自偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵和dabso的化合物。

215、实施方案184：实施方案183的试剂盒，其中所述转化试剂包括亚硫酸氢铵。

216、实施方案185：实施方案175-184中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有样品处理试剂的容器。

217、实施方案186：实施方案185的试剂盒，其中所述样品处理试剂包括硫氰酸胍。

218、实施方案187：实施方案185-186中任一项的试剂盒，其中所述样品处理试剂包括乙醇。

219、实施方案188：实施方案175-187中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有实施方案155-166中任一项的用于样品制备的盒的容器。

220、实施方案189：实施方案175-188中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包含教导使用所述盒来测定dna甲基化的指导材料。

221、实施方案190：用于检测癌症的甲基化标记物的盒，所述盒包括：多个室和热循环通道或室，其中所述多个室和进入所述热循环通道或室的端口排列在中央阀组件的周围并且选择性地处于与所述中央阀组件的流体连通中，其中配置所述中央阀组件以适应柱塞，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室或端口，其中所述多个室包括：样品接收室；包含或经配置以接收亚硫酸氢盐试剂的室；包含洗涤溶液的室；包含tris缓冲液的室；包含碱性溶液的室，所述碱性溶液包括koh；包含提供pcr主混合物的珠的室；和包含珠的室，所述珠提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是癌症的标记物。

222、实施方案191：实施方案190的盒，其中所述多个室包括被设置以接收废液的室。

223、实施方案192：实施方案190-191中任一项的盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包括选自偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵和dabso的化合物。

224、实施方案193：实施方案192的盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢铵。

225、实施方案194：实施方案190-193中任一项的盒，其中所述洗涤溶液包括1.25 mgtc、25 mm tris ph 7.0和50%乙醇。

226、实施方案195：实施方案190-194中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是选自以下的癌症的标记物：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌和肺癌。

227、实施方案196：实施方案195的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供用于巢式pcr反应的pcr引物和探针。

228、实施方案197：实施方案196的盒，其中所述巢式pcr包括特异性针对转化的dna的第一pcr反应和特异性针对甲基化cpg的第二pcr反应。

229、实施方案198：实施方案190-197中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测转化的dna的正向链的甲基化。

230、实施方案199：实施方案190-198中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测转化的dna的反向链的甲基化。

231、实施方案200：实施方案190-199中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因选自

rassf1a、

akr1b1、

hoxb4、

hist1h3c、

rasgrf2、

tm6sf1、

brca1、

bnc1、

adamts1、

cdo1、

sox17、

tac1、

hoxa7和

mgmt。

232、实施方案201：实施方案190-200中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是胰腺癌的标记物。

233、实施方案202：实施方案201的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

adamts1和/或

bnc1的启动子的甲基化。

234、实施方案203：实施方案202的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

adamts1的启动子的甲基化。

235、实施方案204：实施方案202-203中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

bnc1的启动子的甲基化。

236、实施方案205：实施方案202的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供表5或10中所示的用于

adamts1和/或

bnc1的一种或多种pcr引物和/或探针。

237、实施方案206：实施方案190-200中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是乳腺癌的标记物。

238、实施方案207：实施方案206的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测选自以下的一种、两种、三种、四种、五种或全部基因的启动子的甲基化：

brca1、

rassf1a、

akr1b1、

hoxb4、

hist1h3c、

rasgrf2和

tm6sf1。

239、实施方案208：实施方案207的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

brca1的启动子的甲基化。

240、实施方案209：实施方案207-208中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

rassf1a的启动子的甲基化。

241、实施方案210：实施方案207-209中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

akr1b1的启动子的甲基化。

242、实施方案211：实施方案207-210中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

hoxb4的启动子的甲基化。

243、实施方案212：实施方案207-211中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

hist1h3c的启动子的甲基化。

244、实施方案213：实施方案207-212中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

rasgrf2的启动子的甲基化。

245、实施方案214：实施方案207-213中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

tm6sf1的启动子的甲基化。

246、实施方案215：实施方案207-214中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供表5或9中所示的一种或多种pcr引物和/或一种或多种pcr探针。

247、实施方案216：实施方案206的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

brca1的启动子的甲基化。

248、实施方案217：实施方案190-200中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是肺癌的标记物。

249、实施方案218：实施方案217的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测选自

cdo1、

sox17、

tac1和

hoxa7的一种、两种、三种或全部基因的启动子的甲基化。

250、实施方案219：实施方案218的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

cdo1的启动子的甲基化。

251、实施方案220：实施方案218-219中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

sox17的启动子的甲基化。

252、实施方案221：实施方案218-220中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

tac1的启动子的甲基化。

253、实施方案222：实施方案218-221中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

hoxa7的启动子的甲基化。

254、实施方案223：实施方案190-200中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是脑癌的标记物。

255、实施方案224：实施方案223中任一项的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供pcr引物和探针以检测

mgmt的启动子的甲基化。

256、实施方案225：实施方案224的盒，其中包含提供pcr引物和探针以检测一种或多种基因启动子的甲基化的珠的所述室包含这样的珠，即其提供表5或10中所示的mgmt的一种或多种pcr引物和/或探针。

257、实施方案226：实施方案225的盒，其中所述盒包含以下探针和引物，用于使用巢式pcr反应来测定

mgmt的甲基化：

258、外正向引物（248b），其包含核苷酸序列：gtttt(t*)agaayg(t*)tttgygttt（seq idno:263）；

259、外反向引物（249b），其包含核苷酸序列：aaaaaac(t*)ccrcactcttcc（seq id no:265）；

260、内正向引物（250），其包含核苷酸序列：tttcgacgttcgtaggttttcgc（seq id no:266）；

261、内反向引物（251），其包含核苷酸序列：gcactcttccgaaaacgaaacg（seq id no:267）；和

262、探针（252a），其包含核苷酸序列：荧光团-ccaaacac(t*)caccaaatc(n*)caaac-阻断剂（seq id no: 268）。

263、实施方案227：实施方案225-226中任一项的盒，其中所述盒包含以下探针和引物，用于使用巢式pcr反应来测定actb（例如，作为对照）的甲基化：

264、外正向引物（102），其包含核苷酸序列：gtgatggaggaggtttagtaagtt（seq id no:103）；

265、外反向引物（103），其包含核苷酸序列：ccaataaaacctactcctcccttaa（seq id no:104）；

266、内正向引物（148），其包含核苷酸序列：ggtttagtaagttttttggattgtg（seq id no:149）；

267、内反向引物（149），其包含核苷酸序列：ccttaaaaattacaaaaaccacaac（seq id no:150）；和

268、探针（178），其包含核苷酸序列：荧光团-ccaccacccaacaca(n*)caa(t*)aacaaacac-阻断剂（seq id no:179）。

269、实施方案228：从血清或血浆制备cfdna样品的方法，所述方法包括：

270、将蛋白酶k处理的血清或血浆样品与实施方案169-171中任一项的裂解溶液和醇结合以形成样品溶液；

271、将所述样品溶液加样到实施方案143-154中任一项的盒中的样品接收室，或加样到实施方案155-168中任一项的盒中的样品接收室；和

272、操作所述盒以将所述样品中的dna结合至所述亲和基质，然后从所述基质洗涤和释放所述dna。

273、实施方案229：实施方案228的方法，其中所述结合蛋白酶k处理的血清或血浆样品包括以对应于以下的比例结合所述样品、裂解溶液和醇：约1.3 ml蛋白酶k处理的血清或血浆、2.2 ml裂解溶液和约1.5 ml醇。

274、实施方案230：实施方案228-229中任一项的方法，其中所述醇包括异丙醇。

275、实施方案231：实施方案228-230中任一项的方法，其中所述样品包括血清。

276、实施方案232：实施方案228-231中任一项的方法，其中所述样品包括血浆。

277、实施方案233：实施方案228-232中任一项的方法，其中所述样品包括血清。

278、实施方案234：实施方案228-233中任一项的方法，其中操作所述盒包括将所述盒引入到实施方案133-139中任一项的系统中的样品处理模块。

279、实施方案235：实施方案228-234中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述盒以转化所述dna，用于甲基化检测。

280、实施方案236：实施方案228-235中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述盒以使用所述dna或转化的dna作为模板来进行一种或多种pcr反应。

281、实施方案237：实施方案228-234中任一项的方法，其中所述加样包括加载所述样品溶液到实施方案155-165中任一项的盒中的一个或多个样品接收室。

282、实施方案238：实施方案237的方法，其中所述方法还包括将释放的dna转移到第二盒，用于甲基化检测和/或pcr。

283、实施方案239：实施方案238的方法，其中所述第二盒是实施方案92-132中任一项的盒。

284、实施方案240：实施方案238-239中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述第二盒以转化所述dna，用于甲基化检测。

285、实施方案241：实施方案238-240中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述第二盒以使用所述dna或转化的dna作为模板来进行一种或多种pcr反应。

286、实施方案242：实施方案238-241中任一项的方法，其中所述操作所述第二盒包括将所述第二盒引入到实施方案133-139中任一项的系统中的样品处理模块。

287、实施方案243：从ffpe样品制备dna的方法，所述方法包括：

288、将福尔马林固定石蜡包埋的样品与实施方案172-174中任一项的裂解溶液结合；

289、加热包含所述样品的所述裂解溶液；添加醇至所述样品以形成样品溶液；将所述样品溶液加到实施方案143-154中任一项的盒中的样品接收室，或加到实施方案155-168中任一项的盒中的样品接收室；以及

290、操作所述盒以结合所述样品中的dna至亲和基质，然后从所述基质洗涤并释放所述dna。

291、实施方案244：实施方案243的方法，其中所述加热包括将蛋白酶k添加到所述样品中并加热所述样品。

292、实施方案245：实施方案244的方法，其中所述加热包括将约50 µl蛋白酶k添加到约1.2 ml包含ffpe样品的ffpe裂解溶液中。

293、实施方案246：实施方案243-245中任一项的方法，其中所述加热包括加热所述裂解溶液至温度约50℃至约60℃。

294、实施方案247：实施方案246的方法，其中所述加热包括加热所述裂解溶液至温度约56℃。

295、实施方案248：实施方案243-247中任一项的方法，其中所述加热持续最长达约4小时，或最长达约5小时，或最长达约6小时。

296、实施方案249：实施方案248的方法，其中所述加热持续约4小时。

297、实施方案250：实施方案243-249中任一项的方法，其中所述醇包括乙醇。

298、实施方案251：实施方案243-250中任一项的方法，其中所述方法包括以约1:1裂解溶液:醇的体积比将醇添加到所述裂解溶液中。

299、实施方案252：实施方案243-251中任一项的方法，其中操作所述盒包括将所述盒引入到实施方案133-139中任一项的系统中的样品处理模块中。

300、实施方案253：实施方案243-252中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述盒以转化所述dna，用于甲基化检测。

301、实施方案254：实施方案243-253中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述盒以使用所述dna或转化的dna作为模板来进行一种或多种pcr反应。

302、实施方案255：实施方案243-251中任一项的方法，其中所述加样包括将所述样品溶液加到实施方案155-165中任一项的盒中的一个或多个样品接收室。

303、实施方案256：实施方案255的方法，其中所述方法还包括将释放的dna转移到第二盒，用于甲基化检测和/或pcr。

304、实施方案257：实施方案256的方法，其中所述第二盒是实施方案92-132中任一项的盒。

305、实施方案258：实施方案256-257中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述第二盒以转化所述dna，用于甲基化检测。

306、实施方案259：实施方案256-258中任一项的方法，其中所述方法还包括操作所述第二盒以使用所述dna或转化的dna作为模板来进行一种或多种pcr反应。

307、实施方案260：实施方案256-259中任一项的方法，其中所述操作所述第二盒包括将所述第二盒引入到实施方案133-139中任一项的系统中的样品处理模块中。

308、实施方案261：在受试者中检测癌症和/或分期癌症和/或检测癌症易感性的方法，所述方法包括：

309、提供来自所述受试者的生物样品，其中所述生物样品包含dna；

310、利用实施方案190-225中任一项的盒来检测所述dna中一种或多种基因启动子的甲基化，所述基因启动子的甲基化状态是癌症标记物，其中所述一种或多种基因启动子的甲基化的增加指示癌症的存在或癌症易感性或癌症或癌前期的阶段。

311、实施方案262：实施方案261的方法，其中所述受试者是人类。

312、实施方案263：实施方案261-262中任一项的方法，其中所述癌症是选自以下的癌症：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、b细胞淋巴瘤、支气管癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食管癌、宫颈癌、黑色素瘤、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪肉瘤、睾丸癌和恶性纤维组织细胞瘤。

313、实施方案264：实施方案261-262中任一项的方法，其中所述癌症是选自乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌的癌症。

314、实施方案265：实施方案261-264中任一项的方法，其中所述样品包括来自血清或血浆的样品。

315、实施方案266：实施方案261-264中任一项的方法，其中所述样品包括ffpe样品。

316、实施方案267：实施方案261-266中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括一种或多种选自

rassf1a、

akr1b1、

hoxb4、

hist1h3c、

rasgrf2、

tm6sf1、

brca1、

bnc1、

adamts1、

cdo1、

sox17、

tac1、

hoxa7和

mgmt的启动子。

317、实施方案268：实施方案261-266中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌并且所述一种或多种基因启动子包括选自

adamts1和

bnc1的一种、两种、三种或四种基因的启动子。

318、实施方案269：实施方案268的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

adamts1的启动子。

319、实施方案270：实施方案268-269中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

bnc1的启动子。

320、实施方案271：实施方案261-266中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌并且所述一种或多种基因启动子包括选自

brca1、

rassf1a、

akr1b1、

hoxb4、

hist1h3c、

rasgrf2和

tm6sf1的一种、两种、三种、四种、五种或全部基因的启动子。

321、实施方案272：实施方案271的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

brca1的启动子。

322、实施方案273：实施方案271-272中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

rassf1a的启动子。

323、实施方案274：实施方案271-273中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

akr1b1的启动子。

324、实施方案275：实施方案271-274中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

hoxb4的启动子。

325、实施方案276：实施方案271-275中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

hist1h3c的启动子。

326、实施方案277：实施方案271-276中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

rasgrf2的启动子。

327、实施方案278：实施方案271-277中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

tm6sf1的启动子。

328、实施方案279：实施方案261-266中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

brca1的启动子。

329、实施方案280：实施方案261-266中任一项的方法，其中所述癌症是肺癌并且所述一种或多种基因启动子包括选自

cdo1、

sox17、

tac1和

hoxa7的一种、两种、三种或全部基因的启动子。

330、实施方案281：实施方案280的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

cdo1的启动子。

331、实施方案282：实施方案280-281中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

sox17的启动子。

332、实施方案283：实施方案280-282中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

tac1的启动子。

333、实施方案284：实施方案280-283中任一项的方法，其中所述一种或多种基因启动子包括

hoxa7的启动子。

334、实施方案285：实施方案261-266中任一项的方法，其中所述癌症是脑癌并且所述一种或多种启动子包括

mgmt的启动子。

335、实施方案286：将dna中的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，同时使5-甲基胞嘧啶残基基本上不受影响的方法，所述方法包括：

336、使包含dna的样品与dabso接触以转化所述dna；

337、使转化的dna脱磺酸基以产生dna，其中胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶残基基本上不受影响。

338、实施方案287：实施方案286的方法，其中所述接触包括使所述dna与浓度范围从2m至最高达约5 m的dabso接触。

339、实施方案288：实施方案286的方法，其中所述接触包括使所述dna与浓度约2.5 m的dabso接触。

340、实施方案289：实施方案286-288中任一项的方法，其中所述dabso溶解于碱性水溶液中。

341、实施方案290：实施方案289的方法，其中所述dabso溶解于包含koh的溶液中。

342、实施方案291：实施方案286-290中任一项的方法，其中所述接触包括加热dabso/dna溶液至温度范围从约55℃至约90℃。

343、实施方案292：实施方案286-291中任一项的方法，其中使所述dabso与dna反应，持续约15分钟至最长约90分钟。

344、实施方案293：实施方案286-292中任一项的方法，其中所述脱磺酸基包括使所述转化的dna与碱性试剂接触。

345、实施方案294：实施方案293的方法，其中所述碱性试剂包括koh。

346、实施方案295：实施方案286-294中任一项的方法，其中所述转化和/或脱磺酸基在结合至柱的dna上进行。

347、实施方案296：实施方案286-294中任一项的方法，其中所述转化和/或脱磺酸基在溶液中的dna上进行。

348、实施方案297：分析dna甲基化的方法，所述方法包括：

349、提供dna样品；

350、根据实施方案286-296中任一项的方法转化所述样品中的dna；和

351、对转化的核酸进行甲基化特异性pcr和/或核酸测序和/或高分辨率熔解分析（hrm）以测定所述核酸的甲基化。

352、实施方案298：实施方案297的方法，其中所述提供dna样品包括根据实施方案228-234中任一项或根据实施方案243-252中任一项来制备样品。

353、实施方案299：用于检测dna甲基化状态的试剂盒，所述试剂盒包括：

354、包含转化试剂的容器，所述转化试剂包括dabso；和

355、包含脱磺酸基试剂的容器。

356、实施方案300：实施方案299的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有亲和基质的柱。

357、实施方案301：实施方案299-300中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有结合缓冲液的容器。

358、实施方案302：实施方案299-301中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有洗脱缓冲液的容器。

359、实施方案303：实施方案299-302中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有洗涤缓冲液的容器。

360、实施方案304：实施方案299-303中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有实施方案169-171中任一项的裂解溶液的容器，和/或含有实施方案172-174中任一项的裂解溶液的容器。

361、实施方案305：实施方案299-304中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括实施方案143-155中任一项的盒和/或实施方案155-166中任一项的盒。

362、实施方案306：实施方案299-305中任一项的试剂盒，所述试剂盒包括教导使用所述试剂盒来转化核酸以测定所述核酸的甲基化状态的指导材料。

363、实施方案307：用于使用巢式pcr反应来测定

mgmt甲基化的一组引物和探针，所述组包括以下引物和探针：

364、外正向引物，其包含核苷酸序列：gtttt(t*)agaayg(t*)tttgygttt（seq id no:263）；

365、外反向引物，其包含核苷酸序列：aaaaaac(t*)ccrcactcttcc（seq id no:265）；

366、内正向引物，其包含核苷酸序列：tttcgacgttcgtaggttttcgc（seq id no:266）；

367、内反向引物，其包含核苷酸序列：gcactcttccgaaaacgaaacg（seq id no:267）；和

368、探针，其包含核苷酸序列：荧光团-ccaaacac(t*)caccaaatc(n*)caaac-阻断剂（seq id no: 268）。

369、实施方案308：用于使用巢式pcr反应来测定

actb（例如作为对照）甲基化的一组引物和探针，所述组包括以下引物和探针：

370、外正向引物（102），其包含核苷酸序列：gtgatggaggaggtttagtaagtt（seq id no:103）；

371、外反向引物（103），其包含核苷酸序列：ccaataaaacctactcctcccttaa（seq id no:104）；

372、内正向引物（148），其包含核苷酸序列：ggtttagtaagttttttggattgtg（seq id no:149）；

373、内反向引物（149），其包含核苷酸序列：ccttaaaaattacaaaaaccacaac（seq id no:150）；和

374、探针（178），其包含核苷酸序列：荧光团-ccaccacccaacaca(n*)caa(t*)aacaaacac-阻断剂（seq id no:179）。

375、实施方案309：用于使用巢式pcr反应来测定

mgmt甲基化以及测定作为对照的actb的甲基化的引物和探针组，包括实施方案307的引物和探针以及实施方案308的引物和探针。

376、实施方案310：使用甲基化特异性pcr来测定

mgmt甲基化的方法，所述方法包括：

377、提供转化的（例如亚硫酸氢盐转化的）dna，其包含

mgmt基因的启动子区；

378、使用巢式pcr反应进行针对

mgmt甲基化的甲基化特异性pcr，其包括以下引物和探针：

379、外正向引物，其包含核苷酸序列：gtttt(t*)agaayg(t*)tttgygttt（seq id no:263）；

380、外反向引物，其包含核苷酸序列：aaaaaac(t*)ccrcactcttcc（seq id no:265）；

381、内正向引物，其包含核苷酸序列：tttcgacgttcgtaggttttcgc（seq id no:266）；

382、内反向引物，其包含核苷酸序列：gcactcttccgaaaacgaaacg（seq id no:267）；和

383、探针，其包含核苷酸序列：荧光团- ccaaacac(t*)caccaaatc(n*)caaac-阻断剂（seq id no: 268）；以及

384、检测和/或定量pcr扩增产物以测定所述

mgmt基因的甲基化。

385、实施方案311：实施方案310的方法，其中所述方法还包括：

386、提供转化的（例如亚硫酸氢盐转化的）dna，其包含

actb基因（例如作为对照）的启动子区；

387、使用巢式pcr反应进行针对

actb甲基化的甲基化特异性pcr，其包括以下引物和探针：

388、外正向引物，其包含核苷酸序列：gtgatggaggaggtttagtaagtt（seq id no:103）；

389、外反向引物，其包含核苷酸序列：ccaataaaacctactcctcccttaa（seq id no:104）；

390、内正向引物，其包含核苷酸序列：ggtttagtaagttttttggattgtg（seq id no:149）；

391、内反向引物，其包含核苷酸序列：ccttaaaaattacaaaaaccacaac（seq id no:150）；和

392、探针，其包含核苷酸序列：荧光团- ccaccacccaacaca(n*)caa(t*)aacaaacac-阻断剂（seq id no:179）；以及

393、检测和/或定量pcr扩增产物以测定所述

actb基因的甲基化。

394、实施方案312：实施方案310-311中任一项的方法，其中所述针对

mgmt甲基化的甲基化特异性pcr和所述针对

actb甲基化的甲基化特异性pcr在单个多路pcr反应中进行。

395、实施方案313：实施方案310-312中任一项的方法，其中使用实施方案92-132中任一项的盒来进行所述甲基化特异性pcr。

396、实施方案314：实施方案313的方法，其中所述提供包含

mgmt基因的启动子区的转化的dna包括：将包含

mgmt基因的启动子区的未转化的dna引入到所述盒中并操作所述盒以使用转化试剂转化所述盒中的所述dna；和/或所述提供包含

actb基因的启动子区的转化的dna包括：将包含

actb基因的启动子区的未转化的dna引入到所述盒中并操作所述盒以使用转化试剂转化所述盒中的所述dna。

397、实施方案315：实施方案314的方法，其中所述转化试剂包括选自亚硫酸氢铵、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯和dabso的化合物。

398、实施方案316：实施方案313-315中任一项的方法，其中所述操作所述盒包括在热循环通道或室中加热所述dna和所述转化试剂，所述热循环通道或室之后用于进行所述巢式pcr反应。

399、在某些实施方案中，所述方法和/或盒明确地排除磁性材料，包括磁性玻璃、磁性羟基磷灰石和磁性基质材料。在某些实施方案中，所述方法和/或盒明确地排除用于dna分离的磁性材料。