一种转氨酶突变体及其在制备(R)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮中的应用的制作方法

：本发明属于生物催化，具体涉及一种转氨酶突变体及其在制备(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮中的应用。

背景技术

0、 背景技术：

1、(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮，结构如式i所示，cas号为405522-18-1，是一种重要的医药中间体，可以用于开发具有ccr4(趋化因子受体4)拮抗作用的手性内酰胺类衍生物，此类衍生物用于治疗哮喘、过敏性皮炎及与ccr4相关的疾病。未来该手性化合物可用于合成更多的新药。

2、

3、专利cn112300047b公开的(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮的化学法制备路线如scheme 1所示，该路线以芳香酮叔丁酯为原料，在钌(ru)催化的不对称还原胺化及环化串联反应下，得到化合物i。但反应需要在高温高压下，且使用的金属催化剂价格昂贵，生产成本高。

4、

5、吉林大学2013年发表的chin.j.chem.2013,31,1144-1152文章中，以3-甲氧羰基-丙酰氯和溴苯为原料，经7步化学反应得到化合物i，如scheme 2所示，产率仅约30％。且反应条件苛刻，难以工业化。

6、

7、目前，(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮的制备均为化学法合成，尚未有生物酶法合成的报道。因此，我们需要开发一种成本低、催化效率高、操作简单、安全环保且适于产业化的制备方法。

技术实现思路

0、 技术实现要素：

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种转氨酶(ata)突变体并用于制备(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮。

2、一方面，本发明提供了一种新的转氨酶突变体，该突变体是以seq id no.2所示的野生型转氨酶氨基酸序列为参考序列，通过位点突变获得。

3、进一步，所述野生型转氨酶来源于paracoccus denitrificans，野生型模板ncbi的登录号为wp_011750218.1，核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

4、进一步，将野生型转氨酶第122位天冬氨酸(asp)突变为缬氨酸(val)，第126位赖氨酸(lys)突变为亮氨酸(leu)，第245位异亮氨酸(ile)突变为丝氨酸(ser)，第322位苏氨酸(thr)突变为苯丙氨酸(phe)，第379位色氨酸(trp)突变为丙氨酸(ala)，获得转氨酶突变体m-001(d122v/k126l/i245s/t322f/w379a)。

5、进一步，所述转氨酶突变体m-001的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

6、进一步，将将野生型转氨酶第122位天冬氨酸(asp)突变为缬氨酸(val)，第126位赖氨酸(lys)突变为亮氨酸(leu)，第245位异亮氨酸(ile)突变为苏氨酸(thr)，第322位苏氨酸(thr)突变为苯丙氨酸(phe)，第379位色氨酸(trp)突变为甘氨酸(gly)，第422位缬氨酸(val)突变为脯氨酸(pro)，获得突变体m-002(d122v/k126l/i245t/t322f/w379g/v422p)。

7、进一步，所述的转氨酶突变体m-002的核苷酸和氨基酸序列分别如seq id no.5和seq id no.6。

8、更进一步，所述的转氨酶突变体表达于基因工程菌株；

9、更进一步，所述转氨酶表达菌株选自大肠杆菌、酵母菌、链霉菌或枯草杆菌，优选大肠杆菌。

10、另一方面，本发明提供了一种利用转氨酶突变体制备(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮的方法。该方法以4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸甲酯(ii)为底物，在转氨酶的催化作用下转化为化合物i，路线如scheme 3所示。

11、

12、进一步，所述转氨酶选自转氨酶突变体m-001、m-002。

13、更进一步，所述转氨酶突变体以转氨酶酶粉、转氨酶清液、转氨酶均质液、转氨酶冻干粉、含有转氨酶的细胞等形式参与催化反应，优选转氨酶均质液。

14、进一步，反应体系中可以加入辅酶促进反应，所述辅酶为磷酸吡哆醛(plp)。

15、更进一步，添加辅酶的浓度为0.02～0.4g/l，优选0.05g/l。

16、进一步，所述底物浓度为10～100g/l。

17、进一步，所述反应需要控制ph为6.0～8.5，优选ph为8.0。

18、进一步，所述反应温度为20℃～45℃，优选40℃。

19、本发明的有益效果在于，本发明提供了一种新的转氨酶突变体，该突变体可以高效催化化合物ii转化为(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮，底物浓度可达100g/l，转化率＞98％，ee值>99％，该方法操作简单，催化效率高且手性选择性强，可用于工业化生产。

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如seq id no:6所示。

2.如权利要求1所示的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的核苷酸基因序列如seq id no:5所示。

3.如权利要求1所示的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体表达于基因工程菌。

4.一种制备(r)-5-(4-溴苯基)-2-吡咯烷酮的方法，其特征在于，化合物ii在转氨酶的催化作用下，转化为化合物i，所述转氨酶选自权利要求1中的转氨酶突变体，反应方程式如下所示：

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述转氨酶以酶粉、酶液、均质液、冻干粉、含有酶的细胞等形式参与催化反应。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，底物浓度为10～100g/l。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为20℃～45℃。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应需要控制ph为6.0～8.5。