一种经过突变改造的高性能β-葡萄糖醛酸酶及其应用

本发明涉及一种经过突变改造的高性能β-葡萄糖醛酸酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术：

1、甘草是常用大宗中药材，其主要三萜类活性成分是甘草酸（gl）。gl由五环三萜皂苷和两分子葡萄糖醛酸构成，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗高血压、抗高血脂及促进肾上腺皮激素等功效，被广泛的用于食品工业和化妆品领域。单葡萄糖醛酸基甘草次酸（gamg）是甘草酸外侧的β-1,2糖苷键通过水解一分子的葡萄糖醛酸得到的产物，具有更好的水溶性，且其甜度是gl的5倍（蔗糖的900多倍）。具有更好的生物利用度、生物安全性、药用治疗价值，而且结构本身具有更丰富的活性官能团，可作为一种功能型甜味剂应用于食品行业，市场前景广阔。

2、gamg的生产方法主要有两种，分别是化学法和生物法。化学法无法特异性水解目标糖苷键，且存在副产物多、环境不友好和分离纯化成本高等弊端。生物法是利用微生物所生产的β葡萄糖醛酸酶水解甘草酸制备而成，具备底物特异性高、产率高、反应条件温和等优点，成为热门研究方向。目前，用于催化gamg合成的野生型β-葡萄糖醛酸酶主要由真菌发酵生产而来，在实际应用中无法满足工业化生产需求，主要有两个方面的原因，一是真菌产酶生产gamg，发酵周期长、产酶量低、不易于改造。二是大多数野生型的β-葡萄糖醛酸酶会连续水解葡萄糖醛酸（β-1,3糖苷键）生成副产物ga，而能够特异性水解一分子远端葡萄糖醛酸生成gamg的β-葡萄糖醛酸酶非常少，β-葡萄糖醛酸酶水解甘草酸进程如图1所示。

3、针对目前工业化生产gamg存在的技术难点和瓶颈，目前有研究将来源于球毛壳菌（

chaetomium globosumdx-ths3）的β-葡萄糖醛酸酶（cg-gus）在大肠杆菌bl21（de3）中进行异源表达，并对其进行突变改造，提高其底物特异性和催化活性，从而缩短发酵周期、大幅度提高gamg产量和转化率、降低生产成本。但是目前鲜有利用定点突变技术对真菌cg-gus进行改造的文献报道，因此，定点突变改造真菌cg-gus的研究具有极佳的理论和应用价值。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种经过突变改造的高性能β-葡萄糖醛酸酶及其应用，目的在于解决来源于球毛壳菌（

chaetomium globosumdx-ths3）的β-葡萄糖醛酸酶底物特异性不足，难以高效合成gamg的技术问题。的技术问题。

2、本发明提供的第一个技术方案为一种β-葡萄糖醛酸酶突变体，所述突变体为将氨基酸序列如seq id no.1所示的β-葡萄糖醛酸酶亲本进行如下至少一个位点的突变：

3、（1）第 79 位缬氨酸突变为赖氨酸；

4、（2）第 101 位色氨酸突变为赖氨酸；

5、（3）第 278 位谷氨酰胺突变为赖氨酸；

6、（4）第 389 位丙氨酸突变为谷氨酰胺、苯丙氨酸或谷氨酸；

7、（5）第 391 位丙氨酸突变为精氨酸；

8、（6）第 392 位甘氨酸突变为谷氨酰胺；

9、（7）第 394 位缬氨酸突变为精氨酸；

10、（8）第 440 位天冬氨酸突变为赖氨酸；

11、（9）第 474 位天冬酰胺突变为精氨酸；

12、（10）第 501 位缬氨酸突变为赖氨酸；

13、（11）第 532 位谷氨酸突变为色氨酸；

14、（12）第 536 位天冬氨酸突变为色氨酸或谷氨酰胺；

15、（13）第 589 位丝氨酸突变为赖氨酸；

16、（14）第 591 位丙氨酸突变为精氨酸、组氨酸或赖氨酸；

17、（15）第 592 位精氨酸突变为谷氨酸、色氨酸或谷氨酰胺；

18、（16）第 596 位天冬酰胺突变为谷氨酰胺。

19、本发明提供的第二个技术方案为编码第一个技术方案所述突变体的基因。

20、本发明提供的第三个技术方案携带第二个技术方案所述基因的重组载体。

21、在某些实施方式中，所述重组载体以质粒pet28a为表达载体。

22、本发明提供的第四个技术方案为表达第一个技术方案所述突变体，或者含有第二个技术方案所述基因，或者转化有第三个技术方案所述重组载体的宿主细胞。

23、在某些实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

24、本发明提供的第五个技术方案为一种提高β-葡萄糖醛酸酶对底物β-1,2糖苷键特异性的方法，所述方法为对氨基酸序列如seq id no.1所示的β-葡萄糖醛酸酶亲本进行如下任一种突变：

25、（1）第 79 位缬氨酸突变为赖氨酸；

26、（2）第 101 位色氨酸突变为赖氨酸；

27、（3）第 278 位谷氨酰胺突变为赖氨酸；

28、（4）第 389 位丙氨酸突变为谷氨酰胺、苯丙氨酸或谷氨酸；

29、（5）第 391 位丙氨酸突变为精氨酸；

30、（6）第 392 位甘氨酸突变为谷氨酰胺；

31、（7）第 394 位缬氨酸突变为精氨酸；

32、（8）第 440 位天冬氨酸突变为赖氨酸；

33、（9）第 474 位天冬酰胺突变为精氨酸；

34、（10）第 501 位缬氨酸突变为赖氨酸；

35、（11）第 532 位谷氨酸突变为色氨酸；

36、（12）第 536 位天冬氨酸突变为色氨酸或谷氨酰胺；

37、（13）第 589 位丝氨酸突变为赖氨酸；

38、（14）第 591 位丙氨酸突变为精氨酸、组氨酸或赖氨酸；

39、（15）第 592 位精氨酸突变为谷氨酸、色氨酸或谷氨酰胺；

40、（16）第 596 位天冬酰胺突变为谷氨酰胺。

41、本发明提供的第六个技术方案为一种催化剂，所述催化剂为第一个技术方案所述突变体，或者为第五个技术方案所述的宿主细胞制备的全细胞催化剂。

42、本发明提供第七个技术方案为一种生物合成单葡萄糖醛酸甘草次酸（gamg）的方法，所述方法为利用第六个技术方案所述的催化剂水解甘草酸合成gamg。

43、本发明提供的第八个技术方案为第一个技术方案所述的突变体，或者第二个技术方案所述的基因，或者第三个技术方案所述的重组载体，或者第四个技术方案所述的宿主细胞，或者第五个技术方案所述的方法，或者第六个技术方案所述的催化剂在水解含有β-1,2-糖苷键的糖苷类化合物中的应用。

44、在某些实施方式中，所述应用为水解含有β-1,2-糖苷键的糖苷类化合物生成对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物。

45、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

46、相比野生β-葡萄糖醛酸酶，本发明提高了野生酶的底物特异性，使其能将甘草酸特异性的水解为gamg，gamg的产量为30.5 g/l，转化率可达97%，突变酶的比活力为1565 u/mg，底物特异性和酶活力的提高可以有效的降低工业应用的经济成本。