一种百日咳鲍特菌ptxP基因RPA和CRISPR一锅法检测试剂盒及检测方法

本发明涉及等温核酸扩增技术、crispr基因编辑信号放大技术、核酸侧向层析快速检测，具体涉及一种基于ptxp基因特异性识别的百日咳鲍特菌rpa+crispr/cas13一锅法冻干检测试剂盒及现场快速检测方法，属于病原微生物快速poct检测。

背景技术：

1、百日咳是由百日咳鲍特菌（bordetella pertussis）感染引发的急性呼吸道疾病，具有高度传染性。婴幼儿易感、重症率高、隐匿感染占比大，是我国重点防控的呼吸道传染病。目前临床主流检测靶标为is481插入序列，该序列拷贝数高、扩增灵敏度优异，但存在特异性缺陷：is481序列广泛存在于霍氏鲍特菌、支气管炎鲍特菌等近缘菌株中，易造成临床假阳性误诊，无法实现百日咳鲍特菌的精准物种鉴别，给临床诊断、用药指导与流行病学溯源带来极大干扰。

2、百日咳毒素启动子基因ptxp为百日咳鲍特菌独有特异性保守基因，仅存在于致病性百日咳鲍特菌菌株中，近缘鲍特菌及其他呼吸道致病菌无同源序列，是实现百日咳精准检测的特异性靶标。现有百日咳检测技术存在明显短板：细菌培养法检测周期长达3-5天、灵敏度不足、操作较为繁琐；实时荧光定量pcr法灵敏度高、特异性较好，但依赖精密荧光扩增仪器、专业操作人员，检测成本高、检测流程复杂，无法适配基层医疗机构、急诊快速筛查、现场流行病学检测场景。

3、重组酶聚合酶扩增（rpa）是新型恒温核酸扩增技术，可在37-42℃恒温条件下快速完成核酸扩增，无需高温变性、梯度退火程序，仪器依赖性极低，适配poct快速检测场景。但传统rpa扩增产物为dna，无法直接适配crispr/cas13识别体系，且常规分步检测体系操作繁琐、开盖易污染、试剂需现场配制、重复性差、无法常温储运。crispr/cas13系统具备rna特异性识别与强效反式切割信号放大能力，信噪比优异、检测特异性高，是目前核酸快速检测的优质信号放大体系。

4、现有rpa+crispr联合检测技术普遍存在两步法操作繁琐、体系兼容性差、镁离子浓度冲突、多酶共存活性失衡、rna探针易降解、冻干稳定性差、试纸条不匹配导致判读误差大等技术难题，缺乏适配ptxp基因、高特异性、冻干一体化、可现场快速检测的一锅法成熟体系，极大限制了百日咳精准快速检测的临床普及应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种百日咳鲍特菌ptxp基因rpa和crispr一锅法检测试剂盒及检测方法。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种百日咳鲍特菌ptxp基因rpa和crispr一锅法检测试剂盒，包括优选探针组合，该优选探针组合包括rpa扩增引物对及crispr/cas13识别用的crrna，核苷酸序列分别如下：

3、ptxp-f1：

4、taatacgactcactatagggtgcgtgcagattcgtcgtacaaaaccctcg；

5、ptxp-r1：gtcttcccctctgcgttttgatggtgcctat；

6、crrna1：

7、gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacggauguacggaagaaucgaggguuuug。

8、优选的技术方案为：还包括备选探针组合，该备选探针组合包括rpa扩增引物对及crispr/cas13识别用的crrna，核苷酸序列分别如下：

9、ptxp-f2：

10、taatacgactcactatagggaacgcgcatgcgtgcagattcgtcgtacaaaac；

11、ptxp-r2：ccctctgcgttttgatggtgcctattttacg；

12、crrna2：

13、gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacugcaguagcgggauguacggaagaauc。

14、优选的技术方案为：所述试剂盒包括重组酶复合物、链置换聚合酶、单链结合蛋白ssb、t7 rna聚合酶、dntps、rntps、cas13a蛋白、ssrna报告探针、udg-ugi抑制剂、缓冲液。

15、重组酶复合物：t4噬菌体的uvsx蛋白100-200ng/μl，uvsy蛋白60-120ng/μl；链置换聚合酶为bsu dna聚合酶80-120ng/μl；单链结合蛋白ssb为t4噬菌体的gp32蛋白800-1000ng/μl。udg-ugi抑制剂的浓度为40-60ng/μl。缓冲液（包括tris-oac，ph=7.9，50mm浓度，包括k-oac，100mm浓度，包括dtt，4mm浓度，包括atp，2mm浓度）。

16、优选的技术方案为：重组酶复合物、链置换聚合酶、单链结合蛋白ssb、t7 rna聚合酶、dntps、rntps、cas13a蛋白、ssrna报告探针、udg-ugi抑制剂、缓冲液及权利要求1所述的rpa引物与crrna，经冻干保护剂处理后形成冻干饼或者冻干球，即为冻干rpa+crispr反应单元。冻干温度曲线为：-80℃预冻90min，主干燥-45℃10h，终干燥10℃，2h。

17、优选的技术方案为：所述冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、甘露醇、聚乙二醇、牛血清白蛋白、右旋糖酐中的至少一种。

18、优选的技术方案为：所述ssrna报告探针为单链rna序列，其5'端标记荧光基团，3'端标记生物素，rna为8-15nt富含尿嘧啶的核酸序列，无二级结构，可被cas13蛋白高效反式切割。所述ssrna报告探针的序列是fam-uuuuuuuu-biotin。

19、优选的技术方案为：还包括crispr专用核酸免疫层析试纸条，该crispr专用核酸免疫层析试纸条结构为：检测t线包被链霉亲和素sa，结合垫偶联抗-fam彩色乳胶微球，质控c线包被羊抗鸡igy二抗；试纸条适配cas13消线法检测原理，阴性样本t线显色、阳性样本t线消隐、c线恒定显色判定实验有效性。

20、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述百日咳鲍特菌ptxp基因rpa和crispr一锅法检测试剂盒检测百日咳鲍特菌ptxp基因的方法，包括以下步骤：

21、步骤1：样本处理：

22、采用直扩型核酸释放剂处理咽拭子、痰液等临床样本，95℃水浴热裂解3-5min，冷却至室温，取上清作为扩增模板，无需纯化；

23、步骤2：恒温扩增、转录以及crispr信号放大：

24、将核酸粗提液加入所述冻干rpa+crispr反应单元中，投入冻干醋酸镁激活球，涡旋混匀溶解，在37-42℃下孵育10-20min，同步完成dna等温扩增、t7体外转录生成特异性ssrna；特异性ssrna激活cas13/crrna复合物的反式切割活性，随机切割体系内ssrna报告探针，完成信号放大；

25、步骤3：结果判读：

26、取反应液与层析缓冲液混匀后滴加至crispr专用核酸层析试纸条，室温静置3-10min，根据试纸条t线、c线显色情况判定检测结果。

27、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

28、1、特异性高，杜绝近缘菌假阳性：靶向百日咳鲍特菌独有ptxp基因设计，区别于传统is481靶标，可完全区分百日咳鲍特菌与副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管炎鲍特菌，对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、支原体、甲乙流、新冠等常见呼吸道病原体无任何交叉反应，检测特异性100%，解决临床误诊痛点。

29、2、灵敏度高，适配临床低载量样本：结合rpa等温扩增高效富集与cas13超强信号放大双重机制，体系优化后最低检测限低至80 拷贝/ml，可精准检出临床弱阳性、低载量样本，灵敏度显著优于传统培养法，媲美荧光pcr检测水平。

30、3、一锅法冻干体系，操作极简零配液：全套反应组分一体化冻干预封装，搭配独立冻干醋酸镁激活球，无需现场配制复杂反应体系，仅需加样、溶解、恒温孵育三步操作，大幅降低人为操作误差与技术门槛，适用于基层缺乏分子实验条件的应用场景。

31、4、检测极速，全程≤30min出结果：样本热裂解5min、恒温扩增转录信号放大15-20min、试纸判读3-10min，整体检测周期可缩短至30min，远快于荧光pcr（2h以上）与细菌培养（3-5d），适配急诊快速诊断需求。

32、5、体系兼容性强，抗干扰性能优异：优化镁离子折中浓度、多酶配比、缓冲体系与冻干保护剂配方，解决rpa扩增、t7转录、cas13切割多体系共存的活性冲突；添加rnase抑制剂与专用试纸条工艺，杜绝rna探针降解导致的假阳性，适配痰液、咽拭子等复杂临床粗样本。

33、6、储运便捷，稳定性优异：冻干反应单元2-8℃可稳定储存12个月，常温可稳定放置14d不失效；冻干醋酸镁球常温储存12个月活性无衰减，试纸条宽温稳定，无需冷链运输，适配基层、野外、现场筛查场景。

34、7、仪器零依赖，可视化肉眼判读：全程仅需简易恒温设备，无需pcr仪、荧光检测仪等精密设备，依托crispr专用层析试纸条实现肉眼直接判读结果，结果清晰、辨识度高，普适性极强。