一种含硒重组载脂蛋白、含硒蛋白磷脂纳米制剂及其应用

本发明涉及生物医药，具体而言，涉及一种含硒重组载脂蛋白、含硒蛋白磷脂纳米制剂及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（ad）作为一种最常见的神经退行性疾病，是全球范围内导致痴呆的首要原因，给日益严重的老龄化社会带来了沉重的社会经济负担与医疗压力。从病理学特征来看，该类疾病主要表现为脑部细胞外β-淀粉样蛋白（aβ）斑块的沉积、由高磷酸化tau蛋白形成的细胞内神经原纤维缠结，以及在海马和皮层等关键脑区出现的突触和神经元进行性丧失。这些病理改变最终导致患者认知功能的持续下降和记忆力的严重受损。

2、在过去的几十年中，针对该类疾病的治疗研究主要集中在清除β-淀粉样蛋白沉积或抑制tau蛋白聚集等单一靶点上。现有的技术手段大多致力于阻断这些特定的上游致病通路，试图以此延缓或逆转疾病进程。此外，临床上还普遍采用针对神经递质系统的对症治疗药物，以期暂时缓解患者的认知症状。

3、然而，尽管付出了巨大的努力，目前的临床治疗效果仍不尽如人意，针对aβ或tau的单一靶点疗法在临床试验中屡遭挫折，至今尚未出现能够有效改变疾病进程的修饰性疗法。现有技术面临的主要困境在于，ad的上游致病通路具有显著的冗余性与可塑性。疾病的进展往往是由aβ聚集、tau高磷酸化、线粒体功能障碍、氧化还原失衡、铁稳态紊乱以及神经炎症等多种因素共同推动的。针对任何单一上游通路的干预往往难以获得持久疗效，因为神经系统内部复杂的补偿机制仍能使神经退行性病变通过其他路径继续发展。

4、进一步的研究表明，铁死亡作为一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的受调控性细胞死亡形式，是上述多种上游损伤的下游汇聚点。在ad病理环境中，常伴随有过量的铁累积、谷胱甘肽过氧化物酶4（gpx4）等抗氧化防御机制受损以及活性氧（ros）水平升高，这些因素共同创造了有利于铁死亡发生的环境。然而，现有的药物分子往往难以有效补充受损的gpx4活性或直接阻断脂质过氧化过程，难以在复杂的病理环境下提供持续性的神经保护作用。因此，亟需开发一种能够直接靶向铁死亡这一关键下游效应器，并能有效恢复脑内抗氧化防御体系的新型治疗策略。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种含硒重组载脂蛋白、含硒蛋白磷脂纳米制剂及其应用，所述含硒重组载脂蛋白兼具类gpx4活性与跨血脑屏障能力，通过阻断铁死亡、清除β-淀粉样蛋白及修复线粒体的多重协同作用，克服了单一靶点治疗的局限，有效实现了对神经退行性病变的综合干预。

2、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种含硒重组载脂蛋白，所述含硒重组载脂蛋白的氨基酸序列选自以下中的任一种：a、如seq id no: 1所示的氨基酸序列，其中seq id no: 1第56位的氨基酸为硒代半胱氨酸；b、与seq id no: 1所示的氨基酸序列具有90%以上同一性，且在对应于seq id no: 1第56位的氨基酸为硒代半胱氨酸，并具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的蛋白质。

4、第二方面，本发明提供一种含硒蛋白磷脂纳米制剂，所述含硒蛋白磷脂纳米制剂是由如前述实施方式所述的含硒重组载脂蛋白与磷脂通过自组装形成的纳米盘复合物。

5、在可选的实施方式中，所述磷脂为带负电荷的磷脂；优选地，所述磷脂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱中的至少一种；和/或，在所述纳米盘复合物中，所述含硒重组载脂蛋白与所述磷脂的摩尔比为1:(40~200)；优选为1:(60~100)；和/或，所述纳米盘复合物的平均粒径为15nm~25nm。

6、第三方面，本发明提供一种用于制备如前述实施方式所述含硒重组载脂蛋白的生物材料，选自以下任一种：a、编码seq id no: 2所示氨基酸序列的多核苷酸；其中，seq idno: 2为seq id no: 1中第56位硒代半胱氨酸被半胱氨酸替换后的序列；b、含有所述a中所述多核苷酸的表达载体；c、含有所述b中所述表达载体的基因工程宿主细胞，且所述基因工程宿主细胞为半胱氨酸营养缺陷型细胞。

7、第四方面，本发明提供一种如前述实施方式所述含硒蛋白磷脂纳米制剂的制备方法，包括：构建编码seq id no: 2所示氨基酸序列的表达载体，并将所述表达载体转化至半胱氨酸营养缺陷型宿主菌中；其中seq id no: 2为seq id no: 1中第56位硒代半胱氨酸被半胱氨酸替换后的序列；在含有硒代半胱氨酸且不含半胱氨酸的诱导培养基中诱导所述宿主菌表达，裂解菌体并纯化，获得如前述实施方式所述含硒重组载脂蛋白；将所述磷脂分散在含有表面活性剂的缓冲液中，得到磷脂分散液；将所述含硒重组载脂蛋白加入所述磷脂分散液中并进行混合处理，得到混合液；去除所述混合液中的所述表面活性剂，从而引发自组装，获得所述含硒蛋白磷脂纳米制剂。

8、在可选的实施方式中，所述半胱氨酸营养缺陷型宿主菌为大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型菌株；和/或，所述表面活性剂为胆酸钠；和/或，所述混合处理是在超声条件下进行的；和/或，所述去除所述混合液中的所述表面活性剂是通过透析进行的；和/或，在所述混合液中，所述含硒重组载脂蛋白与所述磷脂的摩尔比为1:(40~200)。

9、第五方面，本发明提供一种药物组合物，包括：如前述实施方式中所述的含硒重组载脂蛋白、或如前述实施方式中所述的含硒蛋白磷脂纳米制剂；以及药学上可接受的载体或辅料。

10、第六方面，本发明提供一种跨血脑屏障的药物递送系统，包括：药物递送载体，所述载体为如前述实施方式中所述的含硒蛋白磷脂纳米制剂；以及，负载于所述载体上的客体药物；其中，所述客体药物包载于所述纳米制剂的脂质双分子层中或结合于表面。

11、第七方面，本发明提供前述实施方式所述的含硒重组载脂蛋白、或前述实施方式任一项所述的含硒蛋白磷脂纳米制剂在制备用于防治神经退行性疾病的药物中的应用。

12、在可选的实施方式中，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病。

13、在可选的实施方式中，所述药物的功能包括：抑制神经元铁死亡、清除β-淀粉样蛋白、抑制神经炎症、激活ampk/nrf2信号通路或促进pink1/parkin介导的线粒体自噬。

14、第八方面，本发明提供一种如前述实施方式任一项所述的含硒蛋白磷脂纳米制剂在制备跨血脑屏障药物递送载体中的应用。

15、与现有技术相比，本发明提供的含硒重组载脂蛋白通过在载脂蛋白apoa1骨架的特定位点引入硒代半胱氨酸，成功模拟了谷胱甘肽过氧化物酶4（gpx4）的活性中心，从而赋予了该蛋白强效的类gpx4催化活性。这种结构修饰使得该蛋白能够直接清除病灶区域过量的活性氧，有效抑制由铁依赖性脂质过氧化驱动的铁死亡过程。通过直接靶向这一神经退行性疾病病理机制的关键下游汇聚点，该蛋白能够显著弥补病理状态下受损的内源性抗氧化防御系统，阻断神经元死亡的级联反应，从而在复杂的病理环境中提供持续且稳固的神经保护作用。

16、此外，该含硒重组载脂蛋白保留了apoa1固有的生物学特性，不仅具备跨越血脑屏障进入脑实质的能力，还保持了与β-淀粉样蛋白（aβ）的特异性结合能力。这使得该蛋白在发挥抗氧化和抗铁死亡作用的同时，能够协同促进aβ向溶酶体的转运与降解，并进一步改善线粒体功能障碍，恢复线粒体自噬稳态。这种集抗氧化、抑制铁死亡、清除病理蛋白沉积及修复线粒体功能于一体的多重协同机制，有效克服了传统单一靶点治疗难以应对上游致病通路冗余性与可塑性的缺陷，为早期神经退行性疾病提供了一种能够打破恶性循环、改善认知功能的综合性干预手段。