比活和热稳定性提高的腈水合酶变体及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，更具体地，本发明涉及一种比活和热稳定性提高的腈水合酶变体及其在催化合成酰胺酮洛芬中的应用。

背景技术：

1、酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(nsaids)，此类药物均具有一个手性中心，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性且具有毒副作用{何凤慈等. 酮洛芬及其手性对映体的研究进展[j]. 中国药房, 2004, 15(4):244-246；梅之南等. 右旋酮洛芬的药动学和药效学性质[j]. 中国新药杂志, 1998, 7(005):339-341}。

2、目前，市售（s）-（+）-酮洛芬主要合成方法有传统的化学合成法、手性拆分以及生物酶合成法。化学合成法主要是不对称合成可通过6步反应，由烯丙醇通过sharpless环氧化制备得到（2s，3s）环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在ruo4/naio4的催化下，最终得到右旋酮洛芬，e.e.值达到98%这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物刘继东.酮基布洛芬的合成新方法及拆分新方法研究[d]. 2000；胡琦蔚等.生物催化法制备手性酮基布洛芬的研究进展[j].发酵科技通讯,2017,46(3):153-157}。

3、另有手性拆分方法，专利cn101928214a采用国内廉价易得的（-）-葡辛胺作为拆分剂拆分（rs）-酮洛芬，按一定比例混合后升温回流后降温结晶，对酮洛芬利用率达70%，不过该方法所需时间长，工艺繁杂。目前也有采用高分子印迹聚合物、色谱法对酮洛芬对映体进行拆分{姜吉刚等.分子印迹聚合物拆分消旋体酮洛芬[j].分析试验室, 2004, 23(003):56-58，专利cn102516068b}。此类方法无成本优势，难以直面市场。也有研究利用微生物酶法进行酮洛芬拆分。马燕等人利用紫外诱变得到的微生物菌株在一定条件下进行发酵，利用菌体拆分（rs）-酮洛芬，同时，还利用诺维信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分{马燕等.novozym435催化酮洛芬酯化拆分研究[j].南京工业大学学报（自然科学版）,2015,37(6):54-60,68.}。专利cn103194467a在大肠杆菌中表达来自于古细菌的嗜热酯酶，利用菌体催化酮洛芬乙酯反应生成右旋酮洛芬。该方法最大的不足就是底物浓度低、反应时间长且产物e.e.值仅为90%。利用酯酶的缺点在于拆分率和产物e.e.值都不理想，底物浓度偏低问题也难以解决。

4、生物酶合成法可以一定程度上解决底物浓度和产物e.e.值偏低的问题。目前也有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道。norman layh等以酮洛芬腈为唯一氮原筛选得到的菌株rhodococcus sp. c3ii能将酮洛芬腈转化为（s）-（+）-酰胺酮洛芬，e.e.值为99％，但转化率只有12％{ layh n , knackmuss h j , stolz a .enantioselective hydrolysis of ketoprofen amide by rhodococcus sp. c3ii andrhodococcus erythropolis mp 50[j]. biotechnology letters, 1995, 17(2):187-192.}。

5、r.bauer等利用从根癌农杆菌中纯化得到的腈水合酶催化酮洛芬腈（氰基酮洛芬），（s）-（+）-酰胺酮洛芬的产率为30％，光学纯度大于90%；转化率为50%时，光学纯度下降至80%，转化率达到100%时生成的是外消旋酰胺酮洛芬{ bauer r , knackmuss h j ,stolz a . enantioselective hydration of 2-arylpropionitriles by a nitrilehydratase from agrobacterium tumefaciens strain d3[j]. applied microbiologyand biotechnology, 1998, 49(1):89-95.}。

6、上述所报道的方法转化率或光学纯度仍达不到生产要求，且光学纯度与转化率难以兼得。

7、腈水合酶是一种多亚基的金属酶类，由α亚基、β亚基组成多聚体结构。根据腈水合酶中心所含金属离子的不同，可将其分为铁型和钴型两类。另外，腈水合酶的正确表达还需要组装蛋白（accessory protein）的参与。来源于klebsiella oxytoca的腈水合酶属于钴型腈水合酶，能够催化多种腈类的水解反应。vojtěch vejvoda等报道klebsiella oxytoca的腈水合酶能够水解二苯腈、3-甲苯腈、3-氯苯腈、4-氯苯腈、3-羟基苯腈、4-氨基苯腈、丙腈、丁腈、戊腈、2-甲基-3-丁腈[vojtěch vejvoda, ludmila martínková, alicja b.veselá, kaplan, o. , lutz-wahl, s. ,&fischer, l. , et al. (2011).biotransformation of nitriles to hydroxamic acids via a nitrile hydratase–amidase cascade reaction. journal of molecular catalysis b enzymatic, 71(1-2), 51-55.]。ep1842907a1公开了klebsiella oxytoca的腈水合酶能够水解2-苯基丙腈、扁桃腈、苄腈、苯基乙腈、2-苯基丁腈、2-氨基苯乙腈、丁腈、甲基丙烯腈，并且具有良好的s手性选择性。fa-mou guo等报道klebsiella oxytoca的腈水合酶能够水解丙腈、丁腈、异丁腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰吡啶、苄腈、苯乙腈、α-甲基苯腈、扁桃腈、2，2-二甲基环丙腈、2-(4-氯苯基)3-甲基丁腈，同时对α-甲基苯腈、扁桃腈、2，2-二甲基环丙腈、2-(4-氯苯基)3-甲基丁腈表现出良好的s手性选择性[guo, f. m. , wu, j. p., yang, l. r. ,&xu, g. . (2015). overexpression of a nitrile hydratase fromklebsiella oxytoca kctc 1686 in escherichia coli and its biochemicalcharacterization. biotechnology and bioprocess engine.e.ring, 20(6), 995-1004.]。

8、本研究首次发现来源于klebsiella oxytoca的腈水合酶nh3能够催化氰基酮洛芬的水解反应，并且e.e.值高达98%以上。在（s）-（+）-酰胺酮洛芬的生产中具有较大的应用潜力。但是，腈水合酶nh3在催化氰基酮洛芬到（s）-（+）-酰胺酮洛芬的过程中，酶活力和稳定性较低，使得催化反应中酶加入量较大，生产成本高。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本技术的发明人基于klebsiella oxytoca来源的腈水合酶上，通过理性设计和定向进化的方法，筛选到多个比活和热稳定性提高的腈水合酶变体，这些变体比活为腈水合酶亲本比活的110.1%~526.2%，室温保存稳定性也大幅提高。

2、在本发明的第一方面，本发明提出了一种比活和热稳定性提高的腈水合酶变体。

3、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体包含一个α亚基和一个β亚基，α亚基氨基酸序列如seq id no:1所示或包含选自以下对应于seq id no:1的一个或多个位置的突变：第8位、第36位、第127位、第149位、第172位、第199位，β亚基氨基酸序列如seq id no:2所示或包含选自以下对应于seq id no:2的一个或多个位置的突变：第35位、第37位、第41位、第78位、第101位、第122位、第127位、第170位、第181位、第204位、第208位，且α亚基和β亚基的序列中至少有一个序列为突变后获得；

4、其中，所述腈水合酶变体的α亚基和β亚基的氨基酸位置分别通过于seq id no:1和seq id no:2的氨基酸序列相对来编号的。

5、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体的α亚基氨基酸序列包含选自以下对应于seq id no:1的一个或多个位置处的突变：第8位氨基酸突变成精氨酸，第36位氨基酸突变成半胱氨酸，第149位氨基酸突变成脯氨酸，第172位氨基酸突变成脯氨酸，第199位氨基酸突变成脯氨酸；所述腈水合酶变体的β亚基氨基酸序列包含选自以下对应于seq id no:2的一个或多个位置处的突变：第35位氨基酸突变成半胱氨酸，第37位氨基酸突变成丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或色氨酸，第41位氨基酸突变成丙氨酸，第78位氨基酸突变成精氨酸，第101位氨基酸突变成精氨酸，第122位氨基酸突变成半胱氨酸，第127位氨基酸突变成丙氨酸，第170位氨基酸突变成半胱氨酸，第181位氨基酸突变成半胱氨酸，第204位氨基酸突变成精氨酸，第208位氨基酸突变成亮氨酸。

6、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体包括以下突变点至少两个的组合：

7、α亚基第8位、第36位、第149位、第199位，β亚基第35位、第78位、第101位、第122位、第127位、第170位、第181位、第208位。

8、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体的突变选自下组之一：

9、αl36c, βa35c；

10、βa122c, βv170c；

11、βv170c, βe181c；

12、αl36c, βa35c, βa122c, βv170c；

13、αl36c, βa35c, βv170c, βe181c；

14、αt8r/ αa149p/ αa172p/ αn199p/ βt78r/ βa101r/ βd127a/ βt204r/ βr208l/βf41a中任一个；

15、βf37a/ βf37c/ βf37g/β f37i/β f37l/ βf37m/ βf37s/ βf37w中任一个；

16、αt8r, αn199p；

17、αt8r, βd127a；

18、αa172p, βt78r；

19、αa149p, βa101r；

20、βt78r, βa101r；

21、βr208l, βa101r。

22、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体的α亚基氨基酸序列选自seq id no:1、5、11、12、13、14、29所示的序列，β亚基氨基酸序列选自seq id no:2、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31所示的序列。

23、根据本发明的的实施例，seq id no:1和seq id no:2所示的氨基酸序列来源于klebsiella oxytoca。

24、在本发明的第二方面，本发明提供一种编码上述腈水合酶变体的核苷酸。

25、本发明还提供包含编码腈水合酶变体核苷酸和辅助蛋白（accessory protein）的核苷酸的表达载体及转化的宿主细胞。

26、根据本发明的实施例，所述辅助蛋白选自任意来源的腈水合酶的辅助蛋白，优选氨基酸序列如seq id no:32所示序列的辅助蛋白。

27、根据本发明的实施例，所述表达载体为pet28a载体；

28、任选地，所述的宿主细胞包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、里氏木霉、黑曲霉和米曲霉。

29、在本发明的第三方面，本发明提供了腈水合酶变体制备右旋酰胺酮洛芬的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使氰基酮洛芬在本发明所述的腈水合酶变体的催化下进行酰胺化反应，以便获得右旋酰胺酮洛芬。

30、根据本发明实施例，上述制备右旋酰胺酮洛芬的方法可表示如下：

31、

32、发明人发现，α亚基或β亚基上具有某些氨基酸位点突变的腈水合酶nh3变体对比腈水合酶nh3亲本比活和热稳定性有不同程度的提升，使用腈水合酶变体制备右旋酰胺酮洛芬，可大幅减少催化反应中酶加入量，有效降低生产成本，同时该酶贮藏稳定性也有大幅提升。

33、根据本发明的实施例，上述制备右旋酰胺酮洛芬的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

34、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体α亚基氨基酸序列选自seq id no:1、5、11、12、13、14、29所示的序列，β亚基氨基酸序列选自seq id no:2、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31所示的序列。

35、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体是以腈水合酶发酵菌体的湿菌体、喷干酶粉或冻干酶粉的形式提供的。

36、根据本发明的具体实施例，所述腈水合酶变体发酵菌体是通过如下方式获得的：将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达腈水合酶变体及辅助蛋白的核酸序列；将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得od600为30～35的基础发酵培养菌液；将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在iptg和cocl2存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为4～24h。

37、根据本发明的实施例，所述质粒是以包含腈水合酶nh3核苷酸序列为模板，通过定点突变将一个或者多个氨基酸突变或取代引入腈水合酶nh3序列中，得到的包含腈水合酶变体核酸序列的表达质粒。

38、根据本发明的实施例，所述辅助蛋白为腈水合酶nh3的辅助蛋白。

39、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体的湿菌体、喷干酶粉或冻干酶粉的投料量与氰基酮洛芬质量比为（0.15~4）:1，如0.2:1,0.5:1,1:1。

40、根据本发明的实施例，湿菌体是通过将腈水合酶变体发酵液经过离心、洗涤得到的。

41、根据本发明的实施例，所述喷干酶粉是通过将腈水合酶变体发酵液经过喷雾干燥得到的。

42、根据本发明的实施例，所述冻干酶粉是通过将腈水合酶变体发酵液经过离心、洗涤、超低温预冷、冷冻干燥得到的。

43、根据本发明的实施例，所述腈水合酶变体是分散在有机溶剂中进行催化反应的；

44、任选地，所述有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯和乙酸异丙酯，优选乙酸乙酯；

45、任选地，所述有机溶剂浓度为5%~15%，优选10%。

46、根据本发明的实施例，所述氰基酮洛芬是溶在缓冲溶液中进行催化反应的；

47、任选地，所述缓冲溶液选自磷酸钠、磷酸钾和tris-hcl，优选磷酸钠缓冲溶液；

48、任选地，所述缓冲溶液浓度为0.03~0.5m，ph为7.0-8.0。

49、根据本发明的实施例，所述催化反应温度为25℃~35℃，反应时间为6h~24h。

50、定义

51、在本发明中，将klebsiella oxytoca来源的腈水合酶命名为nh3，如本文中所用的术语“腈水合酶亲本”和“腈水合酶nh3亲本”意指klebsiella oxytoca来源的腈水合酶。

52、如本文所用的术语“腈水合酶”意指一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶。

53、如本文所用的术语“腈水合酶变体”意指氨基酸序列经修饰的腈水合酶，其中该腈水合酶的一个或多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基置换，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已从该腈水合酶中删除，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已被添加和/或插入到该腈水合酶中。

54、如本文所用的术语“iptg”意指异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside），为常用分子生物学试剂，是β-半乳糖苷酶和β-半乳糖透酶的诱导剂。

55、在本文中，所用的术语“e.e.”意指对映体过量(enantiomeric excess)，表示一个对映体对另一个对映体的过量，e.e.值用来描述物质光学纯度。

56、在本文突变点的命名中，第一位字母：α代表α亚基，β代表β亚基；第二位字母为腈水合酶nh3亲本氨基酸；第三位开始直到倒数第二位的数字代表对应于亲本序列编号的位置；最后一位字母代表突变后变体的氨基酸；例如文中突变点“αl36c”，即表示该突变点是由腈水合酶nh3的α亚基氨基酸序列编号的第36位的亮氨酸突变成半胱氨酸所获得的。