基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法与流程

本发明涉及生物医学检测，具体为一种基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法。更具体地，本发明利用微生物转谷氨酰胺酶实现抗体与含双臂单链dna探针的位点特异性偶联，并将所得偶联物应用于构建高性能pea多重蛋白检测体系，适用于科研、转化医学及体外诊断中对数十至数百种低丰度蛋白标志物的同步精准定量。

背景技术：

1、邻近延伸分析是高灵敏蛋白检测技术——邻位连接分析的一种高级变体，其核心原理为：一对针对同一靶蛋白不同表位的抗体，分别偶联一条部分互补的单链dna探针；当两个抗体同时结合到靶蛋白上时，dna探针因空间邻近而发生杂交，形成一个短暂的双链区；随后在dna聚合酶的作用下，以对方为模板进行延伸反应，生成一条完整的、可扩增的双链dna产物；该产物通过qpcr或ngs进行定量，信号强度与靶蛋白浓度相关。pea相比传统pla具有背景更低、特异性更强、更易实现高重数等优势，已成为高通量蛋白组学研究的重要工具。

2、尽管pea前景广阔，但其性能高度依赖于抗体-dna探针偶联物的质量。目前学术界和工业界普遍采用化学偶联法制备探针，存在以下固有缺陷：

3、其一，随机偶联导致探针异质性——修饰发生在抗体表面多个赖氨酸上，导致抗体抗原结合活性部分丧失，每个抗体分子偶联的dna数量和位置不均一，批次间重复性差，难以标准化。

4、其二，空间位阻效应显著——随机连接的dna可能干扰抗体与抗原的结合，或阻碍dna探针间的有效杂交与延伸。

5、其三，酶法定点、定比偶联虽能部分解决位置随机性问题，但n297的糖基化会影响附近的q295定点偶联的效率且定比偶联限制了每个抗体上结合的dna数量，限制了核酸信号的进一步放大。另外酶法现有技术既未揭示、也未教导将pngasef和mtgase介导的fc端定点偶联与pea的dna杂交-延伸机制相结合所能产生的协同效应。

6、因此，本发明旨在提供一种基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，在解决随机偶联问题的同时实现核酸信号的协同放大，从而突破现有pea技术的灵敏度和重复性瓶颈。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，具备dar值均一、灵敏度高、双臂探针信号放大、信噪比优异、高通量等优点，解决了传统化学偶联dar不均、重复性差、位阻干扰的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒，所述试剂盒包含至少一对寡核苷酸-抗体偶联物探针；

4、其中，所述寡核苷酸-抗体偶联物是通过糖基肽酶f（pngasef）去糖基化修饰和微生物转谷氨酰胺酶（mtgase）催化，将寡核苷酸共价连接至抗体fc区域的特定谷氨酰胺残基上而制得；

5、且所述一对探针上的双臂寡核苷酸序列包含部分互补区，可在空间邻近时杂交并作为彼此的延伸模板；

6、所述试剂盒还包含dna聚合酶、dntps混合物、pea反应缓冲液及qpcr或ngs文库构建试剂。

7、进一步，所述特定谷氨酰胺残基为人igg1、igg2或igg4抗体fc段的q295位点；其中，所述抗体fc端n297位点在偶联之前先通过糖基肽酶f（pngasef）进行去糖基化处理。

8、进一步，所述寡核苷酸-抗体偶联物中，每个抗体分子偶联有1.8–2.2个寡核苷酸分子。

9、进一步，所述寡核苷酸还包含通用引物结合区和特异性标签序列，用于qpcr或高通量测序进行多重检测区分。

10、进一步，所述pea反应缓冲液包含10～50mm tris-hcl、20～100mm kcl、1～5mmmgcl2、0.1%～1% bsa及稳定剂。

11、本发明还提供了一种基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒的蛋白检测方法，包括以下步骤：

12、s1、将待测样本与所述至少一对寡核苷酸-抗体偶联物探针共同孵育，使探针对结合目标蛋白；

13、s2、加入dna聚合酶和dntps，在pea反应缓冲液中进行邻近杂交与延伸反应，生成双链dna产物；

14、s3、使用qpcr仪或高通量测序平台对所述dna产物进行定量。

15、进一步，所述s1中，抗体偶联前的去糖基化修饰反应条件为抗体与pngase f的摩尔比为1:0.04，反应温度为30℃，反应时间为1小时，寡核苷酸-抗体偶联反应条件为抗体与探针与mtgase的摩尔比为1:5:0.05，反应温度为30℃，反应时间为2小时。

16、进一步，所述s2中，延伸反应条件为在pea反应缓冲液中，96℃激活聚合酶1分钟，60℃延伸5分钟，95℃灭活5分钟。

17、进一步，所述方法可同时检测10种至384种不同的目标蛋白。

18、与现有技术相比，本发明提供了基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，具备以下有益效果：

19、1、该基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，采用pngase f和mtgase介导的位点特异性偶联，先利用pngase f对igg抗体fc区域的n297位点进行去糖基化处理，然后再用mtgase特异性识别去糖基化igg抗体fc区域的q295位点，并将其作为修饰位点与双臂单链dna的探针精确连接，连接位点远离fab区，完全保留了抗体的抗原结合活性（保留率>97%）；每个抗体分子精确偶联两个dna探针，dar值均一（4.0±0.2），批次间变异系数<8%，从根本上解决了传统化学偶联法中dar值分布宽、批次重复性差的行业痛点。

20、2、该基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，通过双臂寡核苷酸探针设计——每个抗体偶联两个dna探针臂，当一对探针在靶蛋白介导下邻近杂交时，相当于两路核酸信号同时参与延伸反应，实现了核酸信号的协同放大；与传统单臂探针相比，双臂探针使dna产物的扩增效率显著提升，检测灵敏度提高一个数量级以上，检测下限可达0.1～1fg/ml，满足外泌体、稀有细胞因子等超低丰度靶标的检测需求。

21、3、该基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，寡核苷酸探针的3'端延伸互补区仅包含5～8个碱基的短互补序列，该序列在无目标抗原介导的空间邻近条件下，其热力学稳定性不足以维持游离状态下的双链杂交，从根本上消除了非特异性背景延伸；位点特异性偶联避免了随机偶联导致的dna聚集和非特异性吸附，进一步降低了背景信号，信噪比较传统化学偶联pea体系提升10倍以上。

22、4、该基于酶法定点偶联的邻近延伸分析试剂盒及蛋白检测方法，试剂盒兼容用户自有的qpcr或ngs平台，打破了现有pea技术的封闭系统壁垒，具有良好的开放性和通用性；通过探针中唯一标签序列的设计，可同时检测10种至384种不同的目标蛋白，适用于炎症因子谱分析、肿瘤免疫微环境表征及神经退行性疾病生物标志物筛查等大规模蛋白组学研究场景。