一种营养流加半连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法与流程

本发明属于生物法生产氨基酸，公开了一种营养流加半连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法。

背景技术：

1、苯丙氨酸是人体的 “必需氨基酸” 之一，在蛋白质的合成、神经递质的生物合成以及其他生理过程中都起着至关重要的作用。l-苯丙氨酸在医药领域的应用广泛，主要得益于其作为人体必需氨基酸以及在生物化学反应过程中的作用，因为l-苯丙氨酸可在人体转化变为供能物质，所以l-苯丙氨酸配制的氨基酸输液在临床上常用于治疗各种疾病导致的营养不良、手术前后的营养补充等。此外，l-苯丙氨酸还是生产肾上腺素、甲状腺素和黑色素的原料。因此l-苯丙氨酸重要性不言而喻。现有技术已经对l-苯丙氨酸的发酵生产进行了较多研究。例如：

2、“cn202010281544.5，一种生产、分离和纯化l-苯丙氨酸的工艺”，在大肠杆菌发酵中期添加丙氨酸和丙二酸钠，变构抑制丙酮酸激酶和琥珀酸脱氢酶，强化pep流向苯丙氨酸合成，但是存在以下缺陷：过度抑制会影响微生物正常代谢，导致菌体活力下降，发酵后期产酸速率降低。

3、“多策略代谢工程改造大肠杆菌生产l-苯丙氨酸，食品与发酵工业2025年”基于传统代谢工程策略构建生产l-苯丙氨酸的大肠杆菌工程菌，通过解除反馈抑制、优化莽草酸途径关键酶表达水平或活性、启动子工程优化磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖等前体供应、失活副产物乙酸合成途径和优化氨基酸转运途径等手段，获得了一株l-苯丙氨酸生产菌株。但是上述菌株存在菌株构建成本高，遗传稳定性差的缺陷。

4、半连续发酵又称"补料分批发酵"或者"流加发酵"，是指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加营养物质或者全培养基，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术。半连续发酵和传统的分批发酵相比，半连续发酵可以解决底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻退等问题，得到较高的产酸和转化率，使染菌概率小、对发酵过程可实现优化控制等优点。

技术实现思路

1、本发明提供了一种营养流加半连续发酵l-苯丙氨酸的方法，优化了发酵培养基配方、进行营养流加，并优化半连续发酵时的工艺参数，提高l-苯丙氨酸发酵产酸效率，解决发酵中底物抑制、代谢阻退和容易染菌等问题。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的：

3、一种营养流加半连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤（1）种子培养基配制；步骤（2）种子培养；步骤（3）发酵培养基的配制；步骤（4）营养液的配制；步骤（5）半连续发酵生产l-苯丙氨酸。

4、进一步地，所述步骤1）种子培养基配制，包括：取葡萄糖16.8g、酵母粉3.6g、玉米浆12g、七水硫酸镁4.5g、硫酸铵3g、柠檬酸钠 30mg、酪氨酸1.8g、硫胺素16.2mg、磷酸二氢钾0 .3g、磷酸氢二钾 0 .3g、富马酸3g、维生素h 1.2mg，添加到去离子水中，加入氨水调节基ph在6.5，定容至1l，进行灭菌处理15分钟，温度为125℃，冷却即得。

5、进一步地，所述步骤（2）种子培养，包括：将权利要求2所述的种子培养基通入到种子罐中，然后接入产l-苯丙氨酸的大肠杆菌进行种子培养。控制种子罐温度为35℃，控制罐压为0.04mpa、培养时搅拌速度为 180r/min，用氨水控制ph在6.5，培养至od600=3，得到种子液。

6、进一步地，所述步骤（3）发酵培养基的配制，包括：取葡萄糖135g、硫酸镁12g、酵母粉18g、磷酸二氢钾9g、磷酸氢二钾6g、硫酸铵15g、柠檬酸钠4.5g、玉米浆75g、富马酸0.75g、酪氨酸3g、卡那霉素60mg、硫胺素90mg、维生素h6mg，添加去离子水中，定容至1l，进行灭菌处理。

7、进一步地，所述步骤（4）营养液的配制，包括：往去离子水中加入葡萄糖30g、玉米浆18g、谷氨酸钠1.5g，二硫苏糖醇（dtt）2g，定容至1l。

8、进一步地，所述步骤（5）半连续发酵生产l-苯丙氨酸，包括：将种子液按照10-20%接种到含有发酵培养基的发酵罐中维持ph6.5，控制溶氧为20%。当发酵至30h开始流加营养液，流加时溶氧控制在25%，罐压0.05mpa，温度37℃；发酵至36h，从罐中放出50%发酵液并补入同体积发酵培养基，继续发酵24h，得到发酵液a。放出的发酵液流入半连续发酵罐，并往半连续发酵罐中补充发酵培养基，继续发酵24h，得到发酵液b；合并发酵液a和发酵液b，得到总发酵液。

9、优选地，所述步骤（5）半连续发酵生产l-苯丙氨酸，包括：将种子液按照15%接种到含有发酵培养基的发酵罐中，定容至3l，维持ph6.5，控制溶氧为20%；当发酵至30h开始流加营养液，共流加2l，流加时溶氧控制在25%，罐压0.05mpa，温度37℃；发酵至36h，从罐中放出50%发酵液并补入同体积发酵培养基，继续发酵24h，得到发酵液a；放出的发酵液流入半连续发酵罐，并往半连续发酵罐中补充发酵培养基至5l，继续发酵24h，得到发酵液b；合并发酵液a和发酵液b，得到总发酵液。

10、本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：

11、本发明通过在发酵培养基中添加固定浓度的维生素h和硫胺素，共同调节细胞的代谢途径，提高了菌体中酶活、碳源利用率和l-苯丙氨酸产酸，减少了发酵时副产物的积累。

12、本发明采用酶活抑制→代谢物积累→代谢流重定向的调节方式来调控苯丙氨酸发酵。在发酵中后期补充一定浓度的l-谷氨酸，提供氨基供体，促进转氨反应的进行，从而有利于合成苯丙氨酸。通过外加二硫苏糖醇抑制丙酮酸激酶的活性，丙酮酸激酶是糖酵解途径的关键限速酶，其活性被抑制会导致糖酵解通量显著降低，使得细胞内磷酸烯醇式丙酮酸积累，葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸等上游代谢物浓度升高，增加了代谢流流向苯丙氨酸生成的方向。低浓度的dtt对大肠杆菌生长几乎无影响，但可以影响糖酵解途径，一定程度上抑制丙酮酸激酶活性，使代谢流向磷酸戊糖途径有所偏移，从而提高代谢流流向苯丙氨酸合成。高浓度dtt会明显抑制大肠杆菌生长，延长对数生长期，强烈抑制多种含二硫键的酶活性，导致代谢途径严重紊乱，可能导致细胞内氧化还原平衡失衡，甚至引起细胞死亡。

13、本发明通过优化发酵工艺，使用半连续发酵使发酵体系中微生物处于相对稳定的生长状态，减少了代谢产物的积累和副反应的发生，避免了发酵液中有害物质的积累。

1.一种营养流加半连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤（1）种子培养基配制；步骤（2）种子培养；步骤（3）发酵培养基的配制；步骤（4）营养液的配制；步骤（5）半连续发酵生产l-苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）种子培养基配制，包括：取葡萄糖16.8g、酵母粉3.6g、玉米浆12g、七水硫酸镁4.5g、硫酸铵3g、柠檬酸钠 30mg、酪氨酸1.8g、硫胺素16.2mg、磷酸二氢钾0 .3g、磷酸氢二钾 0 .3g、富马酸3g、维生素h 1.2mg，添加到去离子水中，加入氨水调节ph在6.5，定容至1l，进行灭菌处理，即得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）种子培养，包括：将权利要求2所述的种子培养基通入到种子罐中，然后接入产l-苯丙氨酸的大肠杆菌进行种子培养，控制种子罐温度为35℃，控制罐压为0.04mpa、培养时搅拌速度为 180r/min，用氨水控制ph在6.5，培养至od600=3，得到种子液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）发酵培养基的配制，包括：取葡萄糖135g、硫酸镁12g、酵母粉18g、磷酸二氢钾9g、磷酸氢二钾6g、硫酸铵15g、柠檬酸钠4.5g、玉米浆75g、富马酸0.75g、酪氨酸3g、卡那霉素60mg、硫胺素90mg、维生素h 6mg，添加去离子水中，定容至1l，进行灭菌处理。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）营养液的配制，包括：往去离子水中加入葡萄糖20-40g、玉米浆10-20g、谷氨酸钠1-3g，二硫苏糖醇0.5-3g，定容至1l。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）半连续发酵生产l-苯丙氨酸，包括：将种子液按照10-20%接种到含有发酵培养基的发酵罐中，维持ph为6.5，控制溶氧为20%；当发酵至30h开始流加营养液，流加时溶氧控制在25%，罐压0.05mpa，温度37℃；发酵至36h，从发酵罐中放出50%发酵液并补入同体积发酵培养基，继续发酵24h，得到发酵液a；放出的发酵液流入半连续发酵罐，并往半连续发酵罐中补充发酵培养基，继续发酵24h，得到发酵液b；合并发酵液a和发酵液b，得到总发酵液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）半连续发酵生产l-苯丙氨酸，包括：将种子液按照15%接种到含有发酵培养基的发酵罐中，定容至3l，维持ph为6.5，控制溶氧为20%；当发酵至30h开始流加营养液，共流加2l，流加时溶氧控制在25%，罐压0.05mpa，温度37℃；发酵至36h，从发酵罐中放出50%发酵液并补入同体积发酵培养基，继续发酵24h，得到发酵液a；放出的发酵液流入半连续发酵罐，并往半连续发酵罐中补充发酵培养基至5l，继续发酵24h，得到发酵液b；合并发酵液a和发酵液b，得到总发酵液。

8.根据权利要求5-7任其一所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）营养液的配制，包括：往去离子水中加入葡萄糖30g、玉米浆18g、谷氨酸钠1.5g，二硫苏糖醇2g，定容至1l。