一种基于空气eDNA的陆地多类群生物监测方法

本技术属于陆地生物多样性监测，具体涉及一种基于空气edna的陆地多类群生物监测方法。

背景技术：

1、空气环境dna（environmental dna，edna）是指存在于空气悬浮颗粒、生物气溶胶、花粉、孢子、细胞、生物组织碎屑及其附着颗粒中的生物遗传物质。通过对空气中含edna颗粒进行富集、核酸提取和分子检测，可以在不直接捕获生物个体的条件下获得陆生生物的存在及组成信息。

2、陆地生态系统是由陆地表面生物群落及其与环境相互作用构成的统一整体，具有明显的垂直结构。其中，森林生态系统最为经典，其林下近地空间、冠层内部及冠层与大气交换区域在植被结构、生物活动、空气流动和含edna颗粒来源方面存在明显差异。同时，森林空气edna的浓度和组成可随昼夜节律、风速、湿度、降雨及生物活动发生时间变化。因此，传统基于固定单点或单一高度、低频采样方式对于含垂直结构的陆地生态系统多类群生物的监测则难以实现全面覆盖，极易造成生物信息的遗漏。

3、综上，亟需建立以森林为代表的陆地多类群生物的监测方法，以提升陆地生物多样性检测的全面性和准确性。

技术实现思路

1、1. 要解决的问题

2、针对传统基于固定单点或单一高度的空气edna对于环境生物的监测方法不适用于具垂直结构的陆地多类群生物的监测，易造成生物信息遗漏的问题，本技术提供一种基于垂直空间分层、多时间窗口同步连续采样及多类群环境edna联合解析的陆地生物多样性监测方法。根据待测陆地区域的垂直结构信息，针对性设立不同垂直采样层位，针对不同采样层位采用同步连续性采样，一方面减少单一高度采样造成的垂直空间内生物信息的遗漏；另一方面，避免不同垂直采样层位采样时间不一致造成时间混合偏差。同时，通过优化采样频次，有效提高对空气edna动态变化的时间覆盖，最后利用不同分子标记检测体系，实现陆地多生物类群在同一采样体系下的联合动态监测。

3、2. 技术方案

4、为了解决上述问题，本技术所采用的技术方案如下：

5、本技术提供了一种基于空气edna的陆地多类群生物监测方法，该方法包括如下步骤：

6、s1、样本采集、标记：根据待测陆地区域的垂直结构信息确定至少2个垂直采样层位，所述垂直结构信息包括海拔垂直结构信息、植被垂直结构信息、大气圈层垂直结构信息中的一种；每天设置连续n个采样时间窗口对各垂直采样层位的空气进行同步连续采样，4≤n≤6，采样天数≥1天；将同一采样时间窗口内不同垂直采样层位采集的空气样本定义为一个同步样本组t，连续多个（≥n，当采样天数为1天，即为n）采样时间窗口对应形成多个同步样本组，记为t1-tm，m≥4（当采样天数为1天，每天设置4个采样时间窗口，m即为4）；需要说明的是，本技术中待测陆地区域的垂直结构信息可通过现场样地调查、激光雷达测量或已有调查资料等获取；所确定垂直采样层位的具体数量和高度需根据待测区域具体垂直结构信息确定，不限于固定数量和绝对高度；本技术中对具垂直结构的陆地区域设置多个垂直采样层位，并对同一时间窗口内多层位空气样本进行联合检测，能够提高陆地空气edna信息的空间覆盖能力，减少固定单层采样造成的生物信息遗漏；

7、s2、edna提取：对s1中的多个同步样本组t1-tm分别提取edna样本；其中，同步样本组内不同垂直采样层位的空气样本分别进行edna样本提取，用于后续不同垂直采样层位的联合分析；

8、s3、pcr扩增与测序：分别以s2中提取的edna样本为模板，16s f（seq id no.1）和16s r（seq id no.2）、its2 f1（seq id no.3）、its2 f2（seq id no.4）和its2 r（seq idno.5）、线粒体coi f（seq id no.6）和线粒体coi r（seq id no.7）、线粒体16s f（seq idno.8）和线粒体16s r（seq id no.9）为引物，进行多重pcr扩增，构建目的片段文库，进行高通量测序，获各edna样本的测序序列；需要说明的是，本技术中将各同步样本组的空气edna提取物分别用于多个目标生物类群的分子标记扩增；其中，细菌采用16s标记，真菌采用its2标记，昆虫采用线粒体coi标记，脊椎动物采用线粒体16s标记，实现同一采样体系下多类群生物信息同时获取，无需针对每个生物类群分别建立独立的空气edna采样体系，提高多营养级生物监测效率；另外，本技术对于上述四个典型生物类群的监测，不表示本技术仅能监测上述四种生物类群，实际操作中可以根据监测目的选择一个、甚至更多个生物类群，并采用与所选生物类群匹配的分子标记实现扩增；

9、s4、数据处理：对s3中所获各edna样本的测序序列进行质量控制、噪声去除、嵌合序列去除，获各edna样本的asv丰度数据；对于各同步样本组内不同垂直采样层位获得的asv丰度数据，将对应asv的丰度进行逐项累加，形成各同步样本组对应的综合asv丰度数据；然后对所有同步样本组的综合asv丰度数据求平均值，获平均asv丰度数据；最后根据生物分类注释数据库对所获的平均asv丰度数据进行分类注释，按物种聚合asv，获“生物类群×物种”丰度矩阵；需要说明的是，此处先对原始测序序列样品拆分、质量控制、引物去除、序列去噪和嵌合体检查，获得扩增子序列变体asv及其丰度，然后采用genbank数据库对asv进行分类注释，对于昆虫，则结合genbank和bold数据库进行注释，在各生物类群内按物种注释结果（此处只保留注释到物种水平的asv）对asv进行聚合，形成生物类群与物种组合的丰度矩阵；

10、s5、分类鉴定：根据s4中所获丰度矩阵，确定待测陆地区域多生物类群组成情况。

11、本技术中，对同一样品（即同步样本组）中不同分子标记检测获得的细菌、真菌、昆虫、脊椎动物等多类群信息进行整合，实现对陆地区域空气edna的多层位、多时间尺度和多类群联合监测；同时，将连续多个时间窗口的同步采样（即各同步样本组的采样）结果进行关联，获得空气edna群落组成的时间变化信息，实现群落组成变化连续监测。本技术针对陆地区域，提出垂直空间结构、连续多个时间窗口同步采样和多类群分子检测的空气edna综合监测方法，能够有效提高陆地生物多样性监测的空间覆盖能力、时间连续性和生物类群覆盖范围。

12、进一步地，上述s1中待测陆地区域包括森林。

13、进一步地，上述s1中垂直结构信息为植被垂直结构信息。

14、进一步地，上述s1中确定至少3个垂直采样层位。

15、进一步地，上述s1中垂直采样层位至少包括：冠层下方的林下层、冠层内部层、冠层上方的大气边界层。需要说明的是，本技术中垂直采样层位的层位数量和具体高度根据待监测森林的冠层结构和监测目标确定，并不限于固定的层位数量和绝对高度。

16、进一步地，上述s1中同步连续采样包括：将采样设备布设于所述各垂直采样层位的相应高度，按照同一时间基准校时，于相同采样时间窗口同步启动采样和结束采样。需要说明的是，本技术中对多个垂直层位的采样设备进行统一校时，并使各层位在统一时间窗口内启动采样和结束采样，能够使同一组多层位样品对应相同的时间范围（即形成本技术中同步样本组），降低时间混合偏差，提高不同垂直层位数据之间的时间一致性和可比性；其中，各垂直采样层位优选布设相同类型的采样设备，使空气中的生物颗粒、细胞、孢子和生物组织碎屑被截留在具相应富集功能的采集介质上；采样前需对设备的采样流量和累计采气量进行校准。

17、进一步地，上述s1中：每天设置连续6个采样时间窗口，每个时间窗口下对所述垂直采样层位的空气进行同步持续4 h采样。

18、进一步地，上述采样设备的采样流量为30~140 l/min，需要说明的是，本技术中的单次采样时长、采样流量、采样时间窗口及连续采样周期，可根据不同陆地区域类型、空气edna浓度、目标生物类群和具体采样设备进行适应性调整，不限于本技术中提供的固定参数信息。

19、进一步地，上述采样设备的采样流量为120~140 l/min。

20、进一步地，上述s2中：采用硅胶膜柱法或磁珠法提取总edna。

21、进一步地，上述s3中：高通量测序采用高通量二代测序手段。

22、进一步地，上述s4中：用vsearch(v2.14.1)将双端序列合并为完整序列，并按照接头拆分样本，用cutadapt(v3.4)切除引物和接头序列并修建，用dada2获得asv，进一步用vsearch中的uchime算法去除嵌合体，获asv丰度矩阵；用r语言中的decontam安装包去除污染的asv；采用obitools将asv序列比对到genbank数据库进行分类注释；对于昆虫，使用blastn比对自定义参考数据库进行物种鉴定，该数据库由从ncbi genbank和bold systems获取的昆虫coi序列构建，在各生物类群内将asv注释到物种水平，按物种聚合asv，获“生物类群×物种”丰度矩阵。

23、3. 有益效果

24、本技术与现有技术相比，其有益效果在于：

25、（1）提高陆地多生物类群垂直空间信息覆盖能力。以森林为例，根据其垂直结构布设多个垂直采样层位，能够联合林下、冠层内部和冠层上部等不同空间的空气edna信息。在具体实施过程中（实施例1），将上述三层同步联合，平均检出429个物种，相对于每个同步采样事件的最佳单层平均检出值（290个物种），平均新增139个物种，事件级平均提高48.62%。

26、（2）提高不同垂直层位数据的时间一致性。将多个层位按照统一时间基准采样，能够使同一组样品对应相同的时间窗口，降低空间差异与时间差异相互混合造成的偏差。时间错位模拟实验证实，错位4小时、8小时和12小时相对于同步基准的bray-curtis平均距离分别为0.379、0.400和0.406，即群落组成出现一定程度偏离。

27、（3）提高时间动态信息的覆盖能力。连续多时间窗口采样可以获得昼夜及连续监测周期内的空气edna信息。采样频率模拟实验证实，8小时、12小时和24小时降频采样相对于4小时连续采样参考状态的bray-curtis平均距离分别为0.199、0.233和0.322，群落组成随着采样频次的降低出现偏离。

28、（4）实现同一采样体系下的多类群联合获取。将同一批空气环境edna样品结合不同分子标记检测体系，可同时获得多个典型（细菌、真菌、昆虫和脊椎动物）生物类群信息，无需针对每个生物类群分别建立独立空气采样体系，有利于提高多营养级生物监测效率。

29、（5）提高监测流程的标准化和可比性。本技术对垂直采样层位确定、设备校时、流量校准、时间窗口对应、样品采集、样本标记和质量控制进行统一组织，便于对不同层位、不同时间窗口和不同生物类群的监测结果进行联合解析。