一种全预混核酸检测冻干试剂及其制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种可常温保藏的全预混式核酸检测冻干试剂，尤其涉及基于泡腾崩解原理实现快速复溶的核酸检测冻干试剂的制备方法及其多维标准化质量评价体系。

背景技术：

1、核酸检测作为体外分子诊断领域的核心技术，已广泛应用于传染病防控、肿瘤早筛、基因检测等多个场景。传统的核酸检测试剂多为液态试剂，由于其中含有dna聚合酶、逆转录酶等生物活性成分，在常温下稳定性极差，需要低温（通常为-20℃）冷链运输与保藏。这不仅大幅提升了试剂的应用成本，也严重限制了试剂在偏远无冷链条件地区的推广使用，无法满足现场快速检测的需求。

2、为解决液态试剂的保藏问题，相关研究逐步开发出冻干核酸检测试剂。这类试剂通过冷冻干燥去除水分，可实现常温保藏，显著降低了对储运条件的要求。例如，已有专利公开了用于甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒三重检测的qpcr冻干试剂，其由包含酶、引物探针、dntps、mg²⁺、冻干保护剂和添加剂的液体预混液冻干而成。另有研究公开了qpcr全预混液的冻干保护剂及冻干方法，采用纤维二糖和bsa作为冻干保护剂。

3、然而，目前已有的冻干核酸试剂仍存在诸多不足：第一，复溶速度慢。 现有冻干试剂大多仅通过常规冻干工艺制备，冻干产物结构致密，复溶时易出现结块、溶解缓慢的问题，往往需要长时间涡旋振荡才能完全溶解。部分冻干制剂的复溶时间长达56秒甚至数分钟，检测等待时间长，无法满足即时检测（poct）的时效性要求。第二，预混程度不足，操作繁琐。 部分冻干试剂使用前需要分别溶解冻干基质，再按照配比混合各个组分，操作步骤繁琐，容易引入污染。即使是预混型冻干试剂，也往往因冻干保护剂配方不合理或冻干工艺不当，导致复溶后酶活性损失、扩增效率下降。第三，缺乏标准化的质量评价体系。 当前针对冻干核酸试剂的质量评价大多仅聚焦于复溶后的检测性能（如灵敏度、特异性），缺乏涵盖冻干工艺、复溶特性、保藏稳定性、检测灵敏度等多个维度的标准化评价体系，难以全面衡量冻干核酸试剂的产品质量，不利于该类试剂的产业化生产与质量管控。第四，常温保藏稳定性有待提高。 虽然部分冻干试剂可实现常温保存，但保藏期限通常较短，或在常温保藏过程中酶活性衰减明显，无法满足实际应用中对试剂长效稳定性的要求。

4、因此，本领域亟需一种可实现常温长期保藏、秒级快速复溶、操作简便且具有标准化质量评价体系的全预混核酸检测冻干试剂。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种可常温保藏、复溶快、性能稳定的全预混核酸检测冻干试剂及其制备方法，同时建立多维度标准化质量评价体系，以解决现有核酸检测试剂冷链依赖、操作繁琐、复溶慢、稳定性差的行业共性难题。

2、为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明的目的之一在于，提供全预混核酸检测冻干试剂，由冻干保护体系、泡腾崩解体系和检测反应体系三部分组成：

4、（1）冻干保护体系

5、冻干保护体系由以下组分组成：

6、海藻糖，终浓度为0.1 m～0.5 m，优选0.3 m；作为玻璃化保护剂，用于维持生物大分子的天然结构；

7、甘露醇，终浓度为2.0%～6.0%，优选4.0%；作为骨架支持剂，用于防止冻干过程中制品塌陷；

8、peg20000（聚乙二醇20000），终浓度为1.0%～5.0%，优选3.0%；作为蛋白质保护剂，用于减少酶等生物活性成分在冻干过程中的活性损失；

9、消泡剂se-15，终浓度为0.02%～0.15%，优选0.08%；用于降低体系表面张力，抑制冰晶升华过程中气泡的产生和破裂。

10、消泡剂se-15：是一种硅树脂产品，用于防止或减少反应体系中的泡沫，使损伤最小化。产品型号：sigma-aldrich a8582。

11、（2）泡腾崩解体系

12、泡腾崩解体系由以下组分组成：

13、柠檬酸，终浓度为1 mm～5 mm，优选2 mm；作为酸性组分；

14、碳酸氢钠，终浓度为2 mm～8 mm，优选4 mm；作为碱性组分；

15、柠檬酸与碳酸氢钠的摩尔比为1:1～1:3，优选1:2。当冻干试剂复溶时，柠檬酸与碳酸氢钠遇水反应产生二氧化碳气体，实现试剂的快速崩解和溶解。

16、（3）检测反应体系

17、检测反应体系包括：

18、特异性引物和探针，终浓度各自独立地为0.1 μm～1.0 μm；用于靶标核酸的特异性识别和扩增；

19、qpcr反应酶预混液，包含dna聚合酶、逆转录酶、dntps、mg²⁺及缓冲液组分。

20、具体的，全预混核酸检测冻干试剂体系1，由以下成分组成：

21、

冻干保护体系

海藻糖

0.1 m～0.5 m

冻干保护体系

甘露醇

2.0%～6.0%

冻干保护体系

peg20000

1.0%～5.0%

冻干保护体系

消泡剂se - 15

0.02%～0.15%

泡腾崩解体系

柠檬酸

1 mm～5 mm

检测反应体系

引物/探针

0.1 - 1.0 μm

检测反应体系

qpcr反应酶预混液

适量

22、冻干体系2，由以下成分组成：

23、

泡腾崩解体系

碳酸氢钠

2 mm～10 mm

24、优选的，全预混核酸检测冻干试剂体系1，由以下成分组成：

25、

冻干保护体系

海藻糖

0.3m

冻干保护体系

甘露醇

4.0%

冻干保护体系

peg20000

3.0%

冻干保护体系

消泡剂se - 15

0.08%

泡腾崩解体系

柠檬酸

2mm

检测反应体系

引物/探针

0.1 - 1.0 μm

检测反应体系

qpcr反应酶预混液

适量

26、优选的，冻干体系2，由以下成分组成：

27、

泡腾崩解体系

碳酸氢钠

4mm

28、本发明的另一个目的在于提供全预混核酸检测冻干试剂的制备方法，包括以下步骤：

29、（1）预混液配制：将冻干保护体系各组分（海藻糖、甘露醇、peg20000、se-15）、泡腾崩解体系组分（柠檬酸）以及检测反应体系各组分（特异性引物、探针、qpcr反应酶预混液）按顺序充分混合，配制成均一的冻干原液1，泡腾崩解体系组分碳酸氢钠单独配制成冻干原液2；

30、（2）液氮预冻：将所述冻干原液在距离液氮液面1 mm～10 mm处滴加，使液滴迅速冷冻成球形微球；

31、（3）真空冷冻干燥：将预冻微球转移至冻干机中进行三段式干燥；

32、（4）分装保存：将冻干微球在干燥环境下分装密封，常温保存。

33、具体的制备方法，包括以下步骤：

34、步骤一：预混液配制

35、按照上述配方，将冻干保护体系各组分（海藻糖、甘露醇、peg20000、se-15）、泡腾崩解体系组分（柠檬酸）以及检测反应体系各组分（特异性引物、探针、qpcr反应酶预混液）按顺序充分混合，配制成均一的冻干原液1，泡腾崩解体系组分碳酸氢钠单独配制成冻干原液2。

36、步骤二：液氮预冻

37、使用移液枪或自动化微滴生成设备进行冻干产品赋形。其中，移液枪手动操作时，将冻干原液1在距离液氮液面1 mm～10 mm（优选5 mm）处悬空滴加，使液滴迅速冷冻成直径约1 mm～3 mm（优选2 mm）的球形微球，待微球沉入液氮底部后完成预冻。将冻干原液2直接加入八联管内进行预冻。

38、步骤三：真空冷冻干燥

39、将预冻微球和装有冻干原液2的八联管转移至冻干机中，采用三段式干燥工艺：

40、第一阶段（深度冻结）：温度-30℃～-10℃，优选-20℃，维持1～4小时，优选2小时，完成样品的深度冻结；

41、第二阶段（主升华）：温度-50℃～-30℃，优选-40℃，维持8～16小时，优选12小时，完成主升华干燥，去除90%以上的自由水；

42、第三阶段（解析干燥）：温度20℃～30℃，优选25℃，维持2～5小时，优选3小时，完成解析干燥，将水分含量降至2%以下，优选降至1.5%左右。

43、步骤四：分装保存

44、将冻干微球在干燥环境下转移至含冻干碳酸氢钠的八连排管内加盖密封，外包装加封铝箔袋，常温保存。

45、本发明的另一个目的在于提供一种全预混核酸检测冻干试剂的多维度标准化质量评价方法，包括物理稳定性评价、生物活性评价和热稳定性评价三个维度：

46、

物理稳定性

外观

呈球形、不塌陷、光滑饱满

光滑球形，无塌陷

物理稳定性

转移性能

不与耗材粘连，可被镊子夹起转移

转移方便，无粘连

物理稳定性

复溶时间

＜30s，越短越好

≤15s

物理稳定性

水分含量

＜3%

1.5%（均值）

生物活性

检测灵敏度

500copies/ml

500copies/ml

生物活性

25℃保藏时限

δct≤1

rna类 6个月

热稳定性

37℃保藏时限

δct≤1

rna类 60天

热稳定性

56℃保藏时限

δct≤1

rna类 3天。

47、本发明另一个目的在于提供全预混核酸检测冻干试剂在制备病原微生物检测试剂、公共卫生监测试剂或临床诊断试剂中的应用。

48、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

49、1. 突破冷链依赖，显著降低成本。本发明的冻干试剂可在25℃常温下稳定保藏6个月以上，完全无需冷链运输和储存，综合使用成本比传统液态试剂降低20%以上，特别适用于偏远无冷链条件地区的核酸检测。

50、2. 秒级复溶，真正实现即时检测。本发明独创性地将泡腾崩解体系引入核酸检测冻干试剂中，利用柠檬酸与碳酸氢钠遇水反应产生二氧化碳气体的崩解原理，使冻干微球在复溶时迅速崩解分散，复溶时间≤15秒，比现有冻干试剂快2～4倍，真正实现了“即加即测”的即时检测（poct）需求。

51、3. 全预混体系，操作极简。本发明的试剂为全预混体系，所有检测组分（包括酶、引物、探针、dntps、冻干保护剂、泡腾崩解剂）均已预先混合并冻干成微球，使用时无需临用前配制，加入样本后即可直接进行扩增反应，操作时间缩短80%以上，对操作人员的专业要求大幅降低，有效避免了操作过程中引入的污染风险。

52、4. 性能稳定可靠。本发明通过优化冻干保护剂组合（海藻糖+甘露醇+peg20000+se-15）和三段式真空冷冻干燥工艺，最大程度地保护了酶等生物活性成分在冻干和保藏过程中的活性。经验证，本发明的冻干试剂在检测灵敏度、特异性等方面与液态新鲜试剂完全一致，常温保藏6个月后ct值变化δct≤1，无统计学差异（p>0.05）。

53、5. 首创多维度标准化评价体系。本发明首次建立了涵盖物理稳定性（外观、转移性能、复溶时间、水分含量）、生物活性（检测灵敏度、常温保藏稳定性）和热稳定性（37℃、56℃保藏稳定性）三个维度、多个指标的标准化的冻干核酸检测试剂质量评价体系，填补了国内冻干检测试剂质量评价标准的空白，可直接用于指导行业产品研发和质量控制。

54、6. 通用性强，应用前景广阔。本发明的核心配方和工艺已在甲型流感病毒（iav）、新型冠状病毒（cov）、铜绿假单胞菌（pa）、肺炎链球菌（sp）四类病原体的核酸检测试剂中验证成功，仅需调整引物和探针序列即可方便地扩展到其他核酸检测试剂品类。本发明可广泛应用于病原微生物检测、公共卫生监测、临床诊断、食品安全检测、环境监测等多个领域。

55、对于说明书中出现的英文或术语，进行如下解释：

56、qpcr实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time pcr）

57、poct即时检测（point-of-care testing）

58、ct值循环阈值（cycle threshold）

59、δctct值变化差值

60、iav甲型流感病毒（influenza a virus）

61、cov新型冠状病毒（coronavirus，通常指sars-cov-2）

62、pa 铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）

63、sp 肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae）

64、dntps脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates）

65、peg20000聚乙二醇20000（polyethylene glycol 20000）

66、消泡剂se-15（se-15/sigma-aldrich）

67、one step u+ mix一步法qpcr预混液（含dntps、缓冲液等）/诺唯赞ql227

68、one step u+ enzyme mix（glycerol-free）一步法qpcr酶混合液（无甘油）/诺唯赞ql227

69、rna核糖核酸

70、dna脱氧核糖核酸

71、卡尔费休法karl fischer法。