3Keyprocess人工皮肤培养体系及其应用的制作方法

本发明属于人工皮肤培养，具体涉及3 key process人工皮肤培养体系及其应用。

背景技术：

1、近年来，人工皮肤体外培养技术的应用边界正从传统医学领域（包括创伤修复、烧伤治疗及药物毒性筛选）向护肤与活性成分开发领域快速延伸。随着组织工程学、细胞生物学与皮肤科学的深度交叉，基于全层皮肤替代物的体外培养体系已展现出在模拟人体皮肤复杂生理结构与功能方面的独特优势。然而，伴随年龄增长及外界环境刺激的累积，人体皮肤普遍面临敏感、痤疮、暗沉、皱纹等多种功能性衰退问题。上述问题的发生并非单一因素所致，而是紫外线暴露、环境污染、精神压力、饮食结构及内在生理老化等多重因素交互作用的结果，其本质均可追溯至皮肤细胞层面的系统性功能失衡，包括但不限于：屏障结构破坏、线粒体能量代谢障碍、炎症微环境紊乱、细胞外基质降解及细胞间通讯异常。

2、基于上述皮肤问题的多因机制，将能够促进体全层皮肤构建与功能维持的原料组合及培养逻辑迁移应用于护肤品领域，有望为敏感、痤疮、暗沉、皱纹等复合性皮肤问题的预防与改善提供系统性解决方案。但是，现有市售人工皮肤培养液或类器官培养基多聚焦于单一细胞类型的体外维持或特定功效的解决，无法实现对全层皮肤多维度功能失衡的系统性干预体系，导致护肤最终功效停留在碎片化、表层化阶段，难以满足多靶点、多层次的护肤需求。

3、在人工皮肤组织工程领域，体外构建具有完整生理结构与功能的全层皮肤替代物，已成为创伤修复、药物筛选及化妆品功效评价的重要研究方向。然而，现有三维皮肤培养体系在模拟天然皮肤微环境时，仍面临以下三个核心技术瓶颈，严重制约了人工皮肤的生物学活性、结构成熟度及产业化应用：第一，细胞能量代谢失衡诱发衰老级联反应，导致培养体系微环境恶化。在体外长期培养过程中，人工皮肤细胞（尤其是真皮成纤维细胞与表皮基底细胞）持续处于氧化应激与营养波动环境中，极易发生线粒体膜电位下降、线粒体dna损伤及电子传递链功能障碍。线粒体损伤直接引发细胞内三磷酸腺苷（atp）合成耗竭，细胞能量危机进一步激活p53/p21及p16/rb等衰老信号通路，导致细胞提前进入复制性衰老或应激性衰老状态。更为关键的是，衰老细胞会大量分泌衰老相关分泌表型（sasp）因子，包括白细胞介素-6（il-6）、白细胞介素-8（il-8）、基质金属蛋白酶（mmps）及多种趋化因子。这些sasp因子在培养体系中持续累积，形成慢性炎症微环境，不仅加速邻近健康细胞的继发性衰老，还会降解细胞外基质成分，破坏表皮-真皮连接结构，最终导致人工皮肤组织活力衰退、屏障功能不全，现有培养基配方缺乏针对线粒体保护与能量代谢稳态的系统性干预手段。第二，多类型细胞共培养时营养需求错配，难以实现协同生长与功能分化。全层人工皮肤的构建需同时培养多种细胞类型，通常包括表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞及血管内皮细胞等。不同细胞系在增殖速率、代谢表型及分化阶段上存在显著差异，其对氨基酸谱、脂质组成、生长因子浓度及能量底物（如葡萄糖、谷氨酰胺）的需求亦各不相同。现有统一配方的静态培养体系无法动态匹配多细胞共存时的差异化营养需求：一方面，高浓度促增殖因子可能导致成纤维细胞过度生长、分泌异常胶原，引发组织纤维化；另一方面，表皮角质形成细胞因缺乏特定分化诱导因子（如钙离子梯度、维生素a衍生物），难以完成从基底层到角质层的正常分化程序。这种营养供给的“一刀切”模式，使得多细胞体系难以形成稳定的细胞间通讯与功能互补，培养出的皮肤组织往往存在细胞比例失调、分层紊乱等缺陷。第三，缺乏仿生三维支架支撑，细胞无法形成具有层次结构的立体组织。天然皮肤是具有复杂三维拓扑结构的器官，包含表皮层、基底膜带、真皮乳头层及网状层等精密分区，各层之间通过细胞-基质相互作用维持力学稳态与物质交换。现有培养体系多采用二维平面培养或简单胶原凝胶包埋，缺乏模拟天然细胞外基质（ecm）成分与拓扑结构的仿生支架。在二维环境中，细胞失去顶端-基底极性，细胞间连接（如紧密连接、桥粒）发育不全；在无序凝胶中，细胞缺乏定向黏附位点与力学信号传导，无法自发组装成具有表皮突（rete ridge）与真皮乳头（dermal papilla）样互锁结构的多层次立体组织。此外，现有支架材料在降解速率、力学强度及生物活性方面与原生皮肤不匹配，导致细胞黏附不稳定、迁移无序，最终形成的人工皮肤在组织结构上扁平化、功能上成熟度不足，难以满足创伤修复中对机械支撑与屏障重建的双重要求。综上所述，现有的三维皮肤培养体系在模拟天然皮肤微环境时存在培养效率低下、细胞衰老加速以及组织结构幼稚化的问题。因此，亟需开发一种新型培养体系，以实现人工皮肤的高效、稳定、功能化构建。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供3 key process人工皮肤培养体系及其应用，用以解决现有三维皮肤培养体系在模拟天然皮肤微环境时存在培养效率低下、细胞衰老加速以及组织结构幼稚化的技术问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明的第一个方面，公开了3 key process人工皮肤培养体系，包括k1组合物、k2组合物和k3组合物；以重量份计，k1组合物包括0.01~1.00份微球化多聚脱氧核糖核苷酸、0.01~5.00份线粒体能量球肽和0.01~1.00份异槲皮素囊泡；k2组合物包括0.00001~0.1份氨基酸组合物、0.00004~0.4份矿物质盐和0.00004~0.4份维生素组合物；k3组合物包括0.01~8.0份球胶原、1.00~10.00份胶原球肽、0.001~2.0份rgd肽-透明质酸偶联物、0.0001~1.0份弹性蛋白、0.001~0.5份纤连蛋白和0.001~5.00份环球肽。

4、优选地，所述微球化多聚脱氧核糖核苷酸为由活性核心多聚脱氧核糖核苷酸、组装交联载体聚赖氨酸、表层修饰基质氧化透明质酸通过静电自组装技术逐层包覆、交联，形成三维贯通的纳米凝胶微球；所述线粒体能量球肽为基于线链-球体重构自组装技术，以多肽为核心，在两亲性分子驱动下自组装形成的球状纳米颗粒，所述多肽的序列为烟酸-c-c-a-r-b-r-b-r-b-r-a-r-g-d-a-nh2；其中，g为甘氨酸，r和r为精氨酸，d为天冬氨酸，a为酪氨酸，b为色氨酸，c为苯丙氨酸，所述多肽中，r为d构型，其余氨基酸均为l构型；所述rgd肽-透明质酸偶联物为通过酰胺化共价键合，将rgd肽嫁接于透明质酸分子链上形成的功能化透明质酸；所述环球肽为将棕榈酰五肽-4、1,2-戊二醇、1,2-己二醇和水进行超分子组装形成的球形纳米聚合体。

5、优选地，所述微球化多聚脱氧核糖核苷酸为聚苷泰®微球化pdrn，所述线粒体能量球肽为泰束®线粒体能量球肽，所述球胶原为聚苷泰®球胶原，所述球肽为泰束®胶原球肽，所述rgd肽-透明质酸偶联物为粘复泰®rgd酰胺化透明质酸。

6、优选地，所述氨基酸组合物由氨基酸、氨基酸衍生物和类氨基酸衍生物中的至少一种组成；所述矿物质盐为氯化钙、氯化钠和氯化钾中的至少一种；所述维生素组合物为b族维生素。

7、进一步优选地，所述氨基酸为谷氨酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸盐酸盐、脯氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种，所述氨基酸衍生物为乙酰羟脯氨酸，所述类氨基酸衍生物为牛磺酸和肉碱中的至少一种。

8、优选地，所述b族维生素为叶酸、生物素、维生素b12和维生素b5中的至少一种。

9、优选地，还包括其它成分，所述其他成分为保湿剂、肤感剂、功效成分以及溶剂中的至少一种。

10、优选地，所述保湿剂为甘油、1,2-戊二醇和乙基己基甘油中的至少一种；所述肤感剂为透明质酸钠和角鲨烷中的至少一种；所述功效成分为肌肽、白藜芦醇、α-熊果苷、依克多因、软骨素硫酸钠和血清蛋白中的至少一种；所述溶剂为纯化水。

11、优选地，包括k1组合物、k2组合物、k3组合物、保湿剂、肤感剂和溶剂，以重量份计，k1组合物包括0.1份微球化多聚脱氧核糖核苷酸、2.5份线粒体能量球肽和0.2份异槲皮素囊泡；k2组合物包括0.001份氨基酸组合物、0.00004份矿物质盐和0.1003份维生素组合物；k3组合物包括0.1份球胶原、2份胶原球肽、0.001份rgd肽-透明质酸偶联物、0.001份弹性蛋白、0.001份纤连蛋白和0.01份环球肽；保湿剂为6~7份，肤感剂为1~2份，溶剂补足总重量至100份。

12、进一步优选地，保湿剂为6.3份，肤感剂为1.6份。

13、本发明的第二个方面，公开了上述3 key process人工皮肤培养体系在皮肤培养中的应用。

14、本发明的第三个方面，公开了一种皮肤修复制剂，含有上述3 key process人工皮肤培养体系。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、本发明提供的3 key process人工皮肤培养体系，通过系统性整合k1组合物、k2组合物和k3组合物，形成闭环式的“3 key process”培养体系。该体系中，1）k1组合物能够调控线粒体能量代谢稳态，改善细胞线粒体功能、抑制衰老并净化细胞微环境。针对体外培养过程中线粒体损伤及atp耗竭诱发的细胞衰老级联反应，本方案构建以微球化多聚脱氧核糖核苷酸、线粒体能量球肽和异槲皮素囊泡为核心组分的能量修复组合物。其中，微球化多聚脱氧核糖核苷酸作为dna修复成分，能够利用脱氧核糖核苷酸混合物激活细胞dna修复机制，减少dna氧化损伤，维持电子传递链完整性，从源头阻断能量危机引发的p53/p21衰老信号通路激活；线粒体能量球肽作为线粒体靶向成分，能够将线粒体靶向肽递送至细胞能量代谢中枢，通过激活线粒体生物发生相关通路（如pgc-1α/nrf-1轴），促进线粒体新生与膜电位恢复，增强atp合成效率；异槲皮素囊泡作为衰老细胞清除成分，能够清除已进入衰老状态的细胞，阻断sasp炎症因子的级联释放，净化培养微环境。上述三组分通过“修复-保护-清除”的协同机制，重建细胞能量代谢稳态，抑制衰老级联反应，为皮肤细胞提供持续的功能活性支持。2）k2组合物能够适配多细胞类型精准营养，为共培养的多种皮肤细胞类型提供差异化的营养支持。针对全层皮肤构建中多种细胞类型（角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞等）的差异化营养需求，本方案设计氨基酸-矿物质盐-维生素精准配比营养液，其中，氨基酸组合物能够满足细胞增殖与合成需求，矿物质能够精确调控钙、钠、钾等微量元素浓度梯度，调控表皮细胞分化，维生素组合物能够形成覆盖多细胞类型的协同营养网络。该营养液突破了传统一刀切式培养基配方的局限，实现多细胞共培养体系中各细胞类型的同步最优生长与功能分化。3）k3组合物能够起到仿生三维立体支架支撑作用，为皮肤细胞提供模拟天然细胞外基质结构的物理支撑与空间引导。针对现有培养体系缺乏仿生微环境导致细胞无法形成多层次立体结构的问题，本方案构建以球胶原、球肽、rgd肽-透明质酸偶联物、弹性蛋白、纤连蛋白和环球肽为骨架的仿生三维支架。其中，环球肽作为信号引导分子，提供细胞黏附位点与定向迁移线索，促进细胞有序排列；球胶原采用球化胶原技术，模拟天然真皮乳头层与网状层的胶原纤维拓扑结构，为细胞提供力学支撑与生物活性锚定位点；rgd肽-透明质酸偶联物通过透明质酸骨架维持支架水合状态与空间结构，rgd肽序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）特异性识别整合素受体，增强细胞-基质黏附稳定性；弹性蛋白赋予了支架弹性回缩特性，模拟天然皮肤的力学顺应性，引导细胞形成具有表皮突与真皮乳头样互锁结构的三维立体组织。上述组分通过“信号引导-结构支撑-细胞锚定-弹性调控”的协同作用，构建高度仿生的细胞外基质微环境，引导皮肤细胞形成具有完整层次结构的立体组织，重建皮肤屏障功能与力学特性。综上所述，该3 key process人工皮肤培养体系中k2组合物和k3组合物能够协同作用，通过多细胞类型精准营养适配体系对不同细胞亚群的代谢特征进行差异化调控，结合仿生三维立体支架支撑体系为k1组合物提供的物理空间锚定与微环境隔离，有效抑制了k1组合物的聚集、融合及内容物泄漏，延长了k1组合物中活性成分的保存稳定性，从而增强了其在线粒体能量代谢稳态调控中的持续作用效能，适用于体外全层皮肤替代物的构建，能够用于护肤品开发，为敏感、暗沉、皱纹等复合性皮肤问题的系统性解决提供技术支撑。

17、进一步地，矿物质盐中，钙离子浓度梯度用于诱导角质形成细胞从基底层向角质层分化，钠离子作为细胞外液主要阳离子，用于维持培养体系及皮肤组织的渗透压平衡与电解质稳态，保障营养物质的有效跨膜转运；钾离子则参与调控细胞膜电位及与细胞增殖相关的离子通道活性，维持细胞内外的电化学梯度，保障多种细胞类型在共培养体系中的同步健康生长与代谢活性。

18、进一步地，氨基酸组合物包括必需氨基酸与非必需氨基酸，能够兼顾表皮细胞快速增殖与真皮细胞基质合成对氮源的不同需求。

19、进一步地，维生素组合物采用多种b族维生素，其中，叶酸（维生素b9）作为一碳单位转移的辅酶，参与dna合成与细胞分裂，支持表皮角质形成细胞的高频增殖需求；生物素（维生素b7）作为羧化酶辅因子，参与脂肪酸合成与糖异生，维持皮脂腺细胞脂质代谢稳态及皮肤屏障功能；维生素b3、b5、b12等作为多种能量代谢辅酶（如nad+、fad、辅酶a）的构成前体，直接参与三羧酸循环及氧化磷酸化过程，保障细胞atp持续供应。上述维生素通过“增殖支持-脂质代谢-膜保护-能量驱动”的多维协同机制，满足全层皮肤多细胞体系在共培养过程中的差异化营养需求。