适用于免提取核酸检测的泛核酸酶抑制剂及其应用的制作方法

本发明属于核酸保存，特别是涉及适用于免提取核酸检测的泛核酸酶抑制剂及其应用。

背景技术：

1、核酸是脱氧核糖核酸（简称dna）和核糖核酸（简称rna）的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，广泛存在于所有动植物细胞和微生物体内。鉴于核酸在各类生物样本中广泛存在，且其序列构成具有物种及个体特异性，通过对目标dna或rna序列进行定性或定量分析，可有效识别病原体感染、基因突变或遗传缺陷。基于此，核酸分子诊断技术得以建立并广泛应用于临床检验领域。具体的，核酸分子诊断技术在感染性疾病、肿瘤早筛及遗传病检测中发挥着决定性作用。

2、尽管核酸分子诊断技术具有高灵敏度的优点，但是其检测结果的准确性和可重复性严重依赖检测前样本中靶标核酸的完整性和丰度。从样本采集到运输至实验室处理的整个分析过程中，内源性（样本自身释放的）和外源性（环境和耗材污染的）核酸酶会迅速降解目标dna或rna，导致靶标序列断裂、拷贝数降低甚至完全消失，从而引发假阴性结果或者定量偏差。尤其对于低载量病原体样本（病原dna/rna）和微量游离核酸（人体游离核酸cfdna/cfrna），核酸降解造成的信号丢失往往难以通过后续检测技术弥补。因此，在样本采集后立即有效抑制核酸酶活性、维持靶标核酸的完整性，是实现高灵敏度、高置信度核酸分子诊断的前提条件。

3、为了生物样本采集后能够维持靶标核酸的完整性，现有的样本均需要保存于核酸保存液中，理想的核酸保存液应该能够迅速灭活或抑制样本中内源性和外源性的核酸酶，防止核酸降解，同时不干扰后续的核酸检测流程。目前主要的核酸保存液类型如下：

4、（1）以胍盐（如异硫氰酸胍/盐酸胍）为代表的离液剂体系：申请公布号为cn115433763a的中国发明专利申请公开了一种粪便样本中rna病毒核酸保存液，包括变性剂、螯合剂、ph缓冲剂、渗透压调节剂和还原剂，变性剂包括胍盐和表面活性剂，核酸保存液与粪便样本直接进行混合室温保存，在后续核酸检测过程中先进行核酸提取然后利用荧光定量pcr进行检测。上述胍盐是强蛋白质变性剂，虽能灭活核酸酶，但具有无差别攻击性，其残留会强烈毒害并抑制下游所有的酶促扩增体系（如taq dna聚合酶、逆转录酶、转座酶等）。因此，样本必须配合繁琐耗时的核酸提取和纯化过程（如磁珠法或离心柱法），不仅导致微量核酸严重丢失，更直接阻碍了核酸检测向“免提取”、“一步法”及“poct（即时检验）”的方向发展。

5、（2）螯合剂或表面活性剂体系：申请公布号为cn108315327a的中国发明专利申请公开了一种核酸保存液，包括柠檬酸三钠、生物缓冲剂、乙二胺四乙酸二钠、酸度调节剂、防腐剂和余量的水，上述技术方案采用螯合剂乙二胺四乙酸二钠结合其他组分抑制核酸酶，进而提高核酸的组织结构稳定性。但是螯合剂如edta通过螯合二价金属离子抑制核酸酶，会直接剥夺下游pcr极其依赖的mg2+，同时sds等表面活性剂作为强去垢剂则会导致下游核酸检测体系沉淀或酶失活。

6、（3）传统蛋白质类抑制剂（如rnasin等）：申请公布号为cn112680545a的中国发明专利申请公开了一种病毒样本直接扩增型保存液，包括表面活性剂、缓冲剂、盐离子、还原剂、醇和核酸酶抑制剂，核酸酶抑制剂为rna酶的蛋白质抑制剂（rnasin）、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物等。上述rna酶的蛋白质抑制剂极其昂贵且极度依赖冷链（-20℃保存），另外其抑制谱极窄，面对样本中复杂多样的跨物种泛核酸酶（pan-nuclease）往往无效。

7、因此，整个核酸分子诊断技术急需一种既能广谱高效地“锁死”核酸酶活性，又具备对下游各类核酸检测体系（扩增/建库酶）零抑制，从而支持微量核酸免提取直扩的常温样本核酸保存液体系。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供适用于免提取核酸检测的泛核酸酶抑制剂及其应用，以解决现有技术核酸保存液中的核酸酶抑制剂无法兼具广谱性和容易对下游核酸检测体系中的酶产生不利影响的问题。

2、为实现上述目的，本发明第一方面提供了适用于免提取核酸检测的泛核酸酶抑制剂，泛核酸酶抑制剂为由五条核酸适配体组成的混合物；

3、五条核酸适配体的核苷酸序列为以下（a）或（b）：

4、（a）

5、seq id no:1：gcgucaccuacgucgcacggcuggauaccgacg；

6、seq id no:2：cgauccuggaccuugccgaucuagcgguccacuc；

7、seq id no:3：ucgccuuagcuacgucugacgcucggcua；

8、seq id no:4：agucuggaccuaucgcugcauccuggcgcua；

9、seq id no:5：cagcucuaugccgugacguuagcuaccggccgca；

10、（b）

11、seq id no:6：cgcucaccuacgucgcacggcuggucaccgacg；

12、seq id no:7：caauccuggaccuugcggaucuagcggcccacuc；

13、seq id no:8：ccgcccuagcgacgucugacggucggcga；

14、seq id no:9：agucugggccuaucgcugcauccuugcgcua；

15、seq id no:10：cagcucuaugccgugacguuagcuuccgaccgcu；

16、序列中嘧啶碱基的c5位置修饰有萘基、苯丙基或酪氨酸基团。

17、理想的核酸保存液不仅能够将原始生物样本中的核酸酶进行灭活或抑制，而且为了能够在后续核酸检测过程中实现免提取，还要几乎不毒害和抑制下游核酸检测体系中涉及的酶。本发明针对上述要求，提出了一种包括五条核酸适配体的泛核酸酶抑制剂，其作为一种混合物，能够在绝对不含胍盐等强变性剂的条件下，同时广谱抑制生物样本中的多种dna酶和rna酶（多种dna酶和rna酶统称为泛核酸酶），且对下游核酸检测涉及的聚合酶、逆转录酶、转座酶及连接酶等几乎无抑制作用。核酸适配体与核酸酶（dnase/rnase）之间的作用和核酸适配体与下游核酸检测中涉及的酶之间的作用如下：

18、（1）核酸适配体与核酸酶之间的作用：

19、核酸酶的活性中心周围通常存在由芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）和疏水氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）构成的疏水沟槽，该疏水沟槽的作用是识别和结合底物核酸的碱基部分，是核酸酶催化水解的必要结构。本发明核酸适配体中嘧啶碱基的c5位置修饰有双重芳香族或疏水基团，具体为萘基、苯丙基和酪氨酸基团，这使其表面暴露出大体积的疏水芳香环，这些修饰基团能够插入核酸酶的疏水沟槽中，以高亲和力结合核酸酶的活性中心或其邻近的疏水沟槽，发生强烈的π-π堆积和疏水相互作用，同时核酸适配体的核苷酸骨架通过静电作用与核酸酶表面的正电区域结合，形成多重相互作用。本发明利用上述疏水作用和静电作用可以实现核酸适配体和核酸酶之间的高亲和力结合，核酸适配体可以竞争性结合生物样本中的核酸酶进而锁死该核酸酶，抑制生物样本中核酸酶与待检测核酸之间的作用，显著降低核酸酶对于核酸的降解作用，提高后续核酸检测的准确度。另外，核酸适配体结合到核酸酶的活性中心后，暴露的修饰基团会利用其空间位阻机制物理阻塞核酸酶的活性中心，生物样本中原本要被降解的dna/rna底物无法靠近核酸酶的催化位点，因此核酸酶的降解活性几乎被完全抑制。

20、（2）核酸适配体与下游核酸检测中涉及的酶之间的作用：

21、下游核酸检测体系中使用的酶与核酸酶在结构和功能上完全不同，例如聚合酶和逆转录酶等主要负责催化核苷酸聚合反应，其活性中心通常是一个亲水性较强的裂缝，不含有核酸酶中的疏水沟槽，核酸适配体中的修饰基团不能与核酸检测中涉及的酶进行特异性结合，也就不能对其活性产生影响。

22、优选的，当序列中的简并碱基y为胞嘧啶（c）时，修饰基团具体为萘基（nap）或苯丙基（pp），y为nap-dc或pp-dc；当y为尿嘧啶（u）时，修饰基团具体为萘基（nap）或酪氨酸基团（tyr），y为nap-du或tyr-du。

23、本发明这五种核苷酸序列组成的泛核酸酶抑制剂具备对各类dna酶和rna酶的超高亲和力与广谱抑制功能。在核酸保存液中，它们以混合物的形式共同存在。

24、本发明第二方面提供了一种核酸保存液，包括上述的泛核酸酶抑制剂、缓冲剂、渗透压维持剂。

25、优选的，泛核酸酶抑制剂的浓度为1-500nm。更优选的，泛核酸酶抑制剂的浓度为10-100nm。

26、优选的，缓冲剂为tris-hcl、hepes中的至少一种，缓冲剂的浓度为10-50mm，ph7.2-8.0。

27、优选的，渗透压维持剂为氯化钠、蔗糖中的至少一种，渗透压维持剂的浓度为100-200mm。

28、优选的，核酸保存液还包括非离子表面活性剂，非离子表面活性剂为triton x-100、tween-20中的至少一种，非离子表面活性剂的浓度<0.1%。

29、本发明第三方面提供了一种核酸保存液在非疾病诊断目的的体外核酸检测中的应用。

30、优选的，核酸检测包括宏基因组测序、靶向测序、多重pcr、荧光定量qpcr、等温扩增或crispr核酸检测。

31、本发明第四方面提供了一种非疾病诊断目的的体外核酸检测方法，将采集的离体原始生物样本置于核酸保存液中常温运输，然后热裂解得到待检测液；待检测液作为模板液直接进行核酸检测。

32、优选的，离体原始生物样本包括取自人源、非人哺乳动物、细菌、真菌、病毒或环境的样本。

33、优选的，离体原始生物样本的类型包括但不限于血液、脑脊液、肺泡灌洗液、咽拭子、鼻拭子、唾液、粪便、尿液等。

34、本发明采用上述的技术方案，与现有技术相比，至少具有以下有益效果：

35、（1）本发明采用双重芳香族或疏水基团修饰的核酸适配体作为泛核酸酶抑制剂，通过竞争性结合机制和空间位阻机制形成核酸适配体与核酸酶之间的强亲和作用，减少核酸酶对于生物样本中核酸的降解，本发明完全未使用胍盐等强变形剂，核酸适配体可以加入核酸保存液中作为泛核酸酶抑制剂使用。

36、（2）现有技术在下游核酸检测前大多数需要进行核酸保存液中核酸的提取纯化步骤，避免核酸保存液中的成分对核酸检测过程产生影响，而本发明中将核酸适配体作为核酸保存液中的主要成分，其几乎不与核酸检测过程中涉及的酶发生相互作用，因此本发明的核酸保存液无需后续繁琐的核酸提取纯化步骤，仅需要简单的热裂解即可直接作为模板液用于下游核酸检测过程，这极大地减少了微量核酸在提取过程中的损耗，显著降低低载量病原或游离核酸的检测线。

37、（3）本发明筛选得到的核酸适配体能够同时高效抑制生物样本中各类核酸酶，适用于多物种临床样本的核酸检测，克服了传统蛋白类抑制剂抑制谱较窄的问题。

38、（4）本发明的核酸适配体配制成核酸保存液后能够在常温下放置保存，无需冷链运输储存，不仅可以减少运输储存成本，还可以适应基层医疗、家用等场景。

39、（5）本发明中以核酸适配体为主要成分的核酸保存液可直接作为模板液应用于宏基因组测序、靶向测序、多重pcr、荧光定量qpcr、等温扩增或crispr核酸检测等下游核酸检测过程，实现全场景核酸检测，简化操作步骤，缩短检测时间。