一种肺炎支原体快速定量与构建小鼠肺炎模型的方法

本发明涉及生物医药，具体为一种肺炎支原体快速定量与构建小鼠肺炎模型的方法。

背景技术：

1、肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，mp）是一类缺乏细胞壁、能在无生命培养基中独立生长繁殖的最小原核细胞型微生物，也是人类社区获得性肺炎（communityacquired pneumonia，cap）的重要病原体，尤其在儿童和青少年群体中易感。据流行病学调查数据，mp感染所致的肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia, mpp）占儿童cap的10%-40%(kutty pk,et al.clin infect dis，2019)。mp流行模式出现了显著变化：既往非流行季的低龄儿童感染率有所上升，流行季的感染高峰幅度更陡（wu q,etal.microorganisms.2024），耐大环内酯类mp感染率在全球迅速增加（leng, m.d.,et al.frontiers in pediatrics, 2023.），肺炎支原体已成为严重威胁人们身体健康的病原微生物。

2、在肺炎支原体的基础研究和临床前药物评价中，准确、快速地定量mp以及构建稳定可靠的mp感染动物模型是两项核心技术支撑。

3、目前，mp的定量方法主要包括传统培养法、免疫学检测法和核酸检测法三大类。传统mp培养法是将样本用肺炎支原体专用液体培养基培养，由于mp生长缓慢，需要至少4-7天，甚至14天或更长。mp培养阳性是判断mp感染的“金标准”，但不能满足临床快速诊断和科学实验的时效需要。采用荧光、量子点、胶体金等标记的单克隆抗体进行mp检测，具有简单、快速的优点，但局限性在于mp抗原检测的最小敏感度一般为1×106cfu/l，容易出现假阴性（王云东等，医师在线,2020）。临床快速诊断常用血清学检测mp感染机体中出现的特异性抗体igm、igg和iga，但更多是定性检测，无法做到精确定量（刘开运等，j clin lab anal，2019）。核酸检测包括rna检测和dna检测，rna检测的局限性在于rna稳定性差，采集的标本如果没有经过及时前处理，可能出现假阴性（郭丽等，中国循证儿科，2016）。lamp是利用寡核苷酸引物和链置换dna聚合酶在恒温下扩增靶dna，当目标dna被大量扩增时，可以被浊度或者荧光检测。整个检测过程15～60 min即可完成。然而，lamp定量线性区间较窄，精密度略差（吴亮等，临床检验, 2020）。dna检测技术中，荧光定量pcr具有检测快、不易污染、敏感度高和特异度强等优点，且能精确定量，可用于mp感染的早期诊断。然而，荧光定量pcr定量的是mp基因组dna的总拷贝数，无法区分活菌与死菌，且受到mp聚团效应的影响，定量结果与实际活菌数量之间存在偏差，导致定量结果与实际感染剂量不匹配，影响动物模型的感染效果。

4、在肺炎支原体感染动物模型构建方面，目前主流方法均存在明显缺陷。滴鼻法将麻醉后的小鼠以50-100μl菌液间歇滴入小鼠鼻孔使其吸入肺部，该方法操作简单、成本低，但剂量精准度低，菌液易滞留鼻腔和咽喉，肺部沉积不均，个体差异大（吴振起等，中华中医药学，2023）。气溶胶吸入法使用雾化器将菌液制成气溶胶，小鼠置于暴露箱中自然呼吸吸入，该方法最接近自然感染且全肺均匀分布，但设备昂贵、维护复杂、气溶胶生物安全风险高，易污染环境与操作人员。气管滴注法是将小鼠麻醉后暴露气管，注入50μl菌液确保直接进入肺部，该方法剂量精准、肺部沉积均匀、重复性好，但缺点在于对试验人员操作技术要求高，缺乏标准化的操作流程，操作失误易损伤气管或导致感染失败（wanhai qin,,etal.bio protoc.，2022）。

5、本发明是根据实时荧光pcr技术原理，针对人肺炎支原体p1黏连蛋白表达基因mgpa 24而设计的引物及taqman荧光探针，所述引物的序列如seqidno:1以及seqidno:2所示，所述荧光探针序列如seqidno:3所示。本发明的设计的引物和探针能够特异性地检测i型（m129）和ii型（15531）人肺炎支原体，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现快速准确的mp样品的定量。为mp小鼠肺炎模型的构建奠定了基础。

6、综上所述，现有技术中存在以下技术问题：

7、缺乏一种兼具快速性和准确性的经过活菌校准的mp定量方法，mp的荧光定量pcr的定量结果与实际浓度之间缺乏有效的校准手段；

8、现有动物模型构建方法无法同时满足快速精准定量、肺部沉积均匀、操作可重复性高的要求，滴鼻法精度不足，气溶胶吸入法制备成本和安全风险过高，从而带来诸多不便。

9、因此本发明设计了一种肺炎支原体快速定量联合气管插管滴注构建小鼠mp肺炎模型的方法来解决上述出现的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种肺炎支原体快速准确定量与构建小鼠肺炎模型的方法，通过建立一种快速准确的mp定量方法，并配套建立一种标准化、高重复性的气管内滴注感染小鼠肺炎模型构建方法，为肺炎支原体疫苗和治疗药物的临床前研究提供可靠的技术支撑，解决了背景技术中提到的问题。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种技术方案：

3、一种肺炎支原体快速准确定量与构建小鼠肺炎模型的方法，包括以下具体步骤：

4、s1、构建肺炎支原体的荧光定量pcr检测体系，提取肺炎支原体基因组dna，设计qpcr引物和探针，制备标准品并建立标准曲线，获得标准曲线方程y=ax+b，其中y代表ct值，x代表标准品浓度的对数值，a代表标准曲线斜率，b为标准曲线截距;

5、s2、进一步根据本发明设计的计算公式快速计算出每毫升（ml）菌液中mp的理论浓度；

6、s3、采用颜色改变单位法（ccu法）对所述荧光定量pcr检测体系的定量结果进行校准，获得肺炎支原体样本的实际浓度（cfu）；

7、s4、基于校准后的肺炎支原体浓度，将肺炎支原体菌液通过气管内滴注方式感染小鼠，构建小鼠肺炎模型；

8、s5、对感染后的小鼠进行感染效果评价，检测炎症细胞因子表达水平和统计小鼠体重及存活率，评估肺炎支原体感染效果。

9、作为本发明优选的一种实施方式，所述步骤s1中的荧光定量pcr检测体系包括定位于mp基因组中mgpa 24基因（表达p1黏附蛋白）的正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no：3所示。

10、作为本发明优选的一种实施方式，所述步骤s1中的标准品制备包括：提取肺炎支原体基因组dna，取1ng肺炎支原体基因组dna用pbs进行梯度稀释，制备浓度为1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng的标准品，对应lg值的绝对值为0、1、2、3，以标准品浓度的lg值为横坐标、ct值为纵坐标绘制标准曲线。

11、作为本发明优选的一种实施方式，所述步骤s3中的ccu包括：将离心收集的肺炎支原体样本重悬于培养基中，取10支无菌样品管进行10倍梯度稀释，第1管加入0.1ml肺炎支原体样本和0.9ml支原体肉汤，混匀后依次传递稀释至第9管，第10管为空白对照，置37℃培养箱中静置培养7-20天，观察培养基颜色由红变黄的稀释度，确定颜色改变单位值。

12、作为本发明优选的一种实施方式，所述步骤s4中的气管内滴注方式包括：将小鼠麻醉后固定于气管给药专用支架上，使小鼠口腔打开暴露气管口，将给药软管针头插入气管内，将肺炎支原体菌液缓慢滴入气管，将小鼠置于恒温垫上苏醒后放回鼠笼。

13、作为本发明优选的一种实施方式，所述步骤s4中的每只小鼠感染剂量包括1.0×108cfu/只、2.5×108cfu/只、5.0×108cfu/只和1.0×109cfu/只四个梯度，感染体积为50μl/只。

14、作为本发明优选的一种实施方式，所述步骤s5中的炎症细胞因子包括il-6和tnf-α，通过elisa法检测小鼠血清中il-6和tnf-α的表达水平；所述体重统计为每日称量记录小鼠体重，观察周期为14天；所述存活率统计为以体重降低超过20%记为死亡，计算各组小鼠死亡率,最后得到1.0×109cfu为完全至死剂量。

15、作为本发明优选的一种实施方式，所述mp的荧光定量pcr检测体系基于传统荧光定量pcr技术，所设计的公式可快速计算出mp菌液的理论cfu；

16、所述肺炎支原体定量检测是通过颜色改变单位法对肺炎支原体样本进行荧光定量pcr检测结果校准，输出校准后的肺炎支原体实际浓度；

17、所述小鼠肺炎模型构建根据所述肺炎支原体定量校准后的实际浓度，对小鼠进行气管内滴注感染，构建小鼠肺炎模型，并进行感染效果评价。

18、作为本发明优选的一种实施方式，所述肺炎支原体定量检测包括荧光定量pcr检测、颜色改变单位校准和浓度计算，所述荧光定量pcr检测、颜色改变单位校准和浓度计算的连接；

19、所述荧光定量pcr检测依靠提取肺炎支原体基因组dna作为标准品，采用荧光定量pcr引物和探针进行扩增检测，获取样品ct值并建立标准曲线；

20、所述颜色改变单位法校准是通过对肺炎支原体样本进行10倍梯度稀释，获取能够发生颜色变黄的最高稀释梯度作为ccu定量结果，得到对qpcr定量结果的校准系数为0.1；

21、所述浓度计算公式根据样品ct值、标准曲线参数和ccu校准系数，计算肺炎支原体样本的实际浓度；

22、所述小鼠肺炎模型构建包括气管内滴注感染和感染效果评价，所述气管内滴注感染与感染效果评价的连接；

23、所述气管内滴注感染是将麻醉后的小鼠固定于气管给药专用支架上，通过气管内滴注方式将校准了浓度的肺炎支原体菌液注入小鼠肺部；

24、所述感染效果评价是检测感染后小鼠血清中il-6和tnf-α炎症细胞因子表达水平，统计小鼠每日体重变化和存活率，输出感染效果评价报告。

25、本发明的有益效果是：本发明通过ccu法对荧光定量pcr定量结果进行校准，消除了qpcr同时检出活菌和死菌游离dna所导致的定量偏差，以及肺炎支原体严重的聚团效应且难分散和mp细胞存在分裂不分离、多基因组共存的问题。经多次生物学独立实验验证，ccu定量结果为荧光定量pcr结果的约十分之一（0.1），本发明将该偏差作为校准系数纳入计算公式，使最终获得的mp浓度更真实地反映具有感染活力的活菌数量，为后续动物实验的感染剂量精确控制提供了可靠依据；本发明采用气管内滴注方式进行mp感染，通过专用器官给药支架和标准化操作流程，将小鼠固定后直接经口腔暴露气管进行滴注，菌液直接进入肺部，避免了滴鼻法中菌液滞留鼻腔/咽喉导致的剂量不准问题，肺部沉积均匀，个体差异小，模型重复性好；

26、本发明将肺炎支原体定量检测与小鼠肺炎模型构建连接，形成了从样本定量、剂量计算、气管滴注和效果评价的完整闭环，实现实验流程的标准化，有利于mp疫苗和治疗药物研发中对操作规范化，动物模型稳定性和高可重复性的要求；本发明采用的气管内滴注方式无需手术暴露气管，通过专用支架打开小鼠口腔即可暴露气管口进行滴注，避免了传统气管切开术对小鼠的创伤，提高了建模成功率和实验效率。