一种检测GPCR内化的荧光素酶互补探针及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种基于荧光素酶互补技术的蛋白动态互作探针及其应用。

背景技术：

1、g蛋白偶联受体（g protein-coupled receptor，gpcr）是真核生物细胞膜上数量最大、功能最核心的跨膜受体超家族，可识别激素、神经递质、细胞因子等多种胞外信号分子，启动胞内信号通路，调控细胞增殖、代谢、分化、凋亡等几乎所有生命活动。

2、细胞内化是gpcr激活后最关键的负反馈调控与信号重塑机制，指激活态gpcr从细胞膜表面通过内吞作用转入胞内囊泡结构的全过程。静息状态下，gpcr稳定定位于细胞膜脂质双分子层，并与胞内异源三聚体g蛋白（gα、gβγ）结合，无内化活性。当胞外配体特异性结合gpcr胞外结构域后，受体构象发生剧烈改变，激活胞内g蛋白并启动初级信号传导，同时触发内化启动程序。该过程依赖两个大核心关键分子，即介导gpcr磷酸化的gpcr激酶和负责阻断g蛋白与受体结合的β-抑制蛋白（β-arrestin）。其中，β-arrestin一方面介导g蛋白信号脱敏，另一方面作为支架蛋白进一步招募ap2、clathrin等内化相关蛋白，将受体复合物引导至网格蛋白包被小窝，从而启动网格蛋白介导的内化过程。

3、在gpcr内化过程中，β-arrestin与clathrin的互作是受体复合物进入网格蛋白包被结构的关键步骤之一。该互作决定了受体是否被有效招募包被小窝，进而影响受体的胞内转运、循环再利用、降解以及后续信号输出。β-arrestin分子存在两个关键结合结构域，可同时衔接上游gpcr与下游内吞复合物，形成串联调控：一方面，β-arrestin的n端结构域特异性结合grks磷酸化后的gpcr胞内段，稳定锚定激活态受体；另一方面，其c端结构域含有高度保守的网格蛋白结合基序与ap2结合位点，可直接结合clathrin重链及细胞膜锚定蛋白ap2复合物。这种双重结合特性使β-arrestin同时充当“受体脱敏终止因子”与“内吞支架衔接蛋白”。该互作具有严格的特异性，仅磷酸化的gpcr可启动β-arrestin与clathrin的结合，未激活或非磷酸化的受体则无法触发该过程。

4、gpcr内化异常是多种疾病的核心发病机制，内化过度或不足均会导致信号紊乱：内化缺陷会造成受体持续激活，引发信号过度亢进，从而导致高血压、心律失常、哮喘等疾病；而内化过度、受体降解过多会引发细胞信号脱敏、响应迟钝，则会引发糖尿病、甲状腺功能异常、神经退行性病变等。此外，肿瘤细胞可通过调控gpcr内化效率，异常激活增殖、侵袭相关信号通路，从而促进肿瘤发生、转移与耐药。目前，gpcr是药物研发最核心的靶点蛋白家族，超过30%的临床药物以gpcr为作用靶点。通过精准调控受体内化效率、分选命运与胞内信号传导，可特异性纠正异常信号通路，减少传统药物的脱靶效应与耐药性，为心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、代谢性疾病的精准治疗提供全新策略。

5、因此，实时检测β-arrestin与clathrin的动态组装过程，对于解析gpcr内化机制、研究受体偏向性信号以及发现调控内化的新型药物具有重要意义。

6、现有gpcr内化检测方法主要包括荧光显微成像、elisa、流式细胞术、bret/fret以及基于受体表面表达量变化的检测方法。这些方法虽然可以反映受体从细胞膜消失或在胞内囊泡累积的结果，但普遍存在不足，如多数方法检测的是内化后的下游结果，不能直接报告β-arrestin与clathrin的组装事件；显微成像方法空间信息虽丰富，但通量较低，难以适用于大规模药物筛选；终点检测方法则难以反映蛋白互作的动态过程。综上，现有技术缺乏能够直接、实时、高通量检测β-arrestin/clathrin互作的药理学探针。

7、荧光素酶互补技术是一种灵敏、快速、适用于活细胞的蛋白互作检测技术。nanoluc可被拆分为lgbit和smbit两个片段。当两个片段分别融合至两个互作蛋白时，若目标蛋白发生相互作用，则lgbit和smbit在空间上接近并重构具有活性的nanoluc，从而催化底物产生发光信号。该技术具有背景低、动态范围大、检测方便、适合多孔板读数和高通量筛选等优点。

8、综上所述，开发一种能够直接检测gpcr内化过程中β-arrestin与clathrin动态互作的nanoluc荧光素酶互补探针，对于基础研究和药物筛选均具有重要价值。

技术实现思路

1、本发明基于gpcr内化过程中β-arrestin与clathrin的相互作用，构建了一种nanoluc荧光素酶互补探针，该探针在gpcr激动剂刺激后能够产生明显的发光动力学响应，具有较好的信噪比、时间分辨率和药理学检测特征，能够用于gpcr内化机制研究和高通量药物筛选。基于此，完成本发明。

2、第一方面，本发明提供一种荧光素酶互补探针，所述探针分别由两种融合蛋白组成，所述两种融合蛋白包括连接nanoluc荧光素酶小亚基的β-arrestin蛋白亚基和连接nanoluc荧光素酶小亚基的clathrin蛋白亚基，所述nanoluc荧光素酶小亚基选自smbit或lgbit中的一种，所述β-arrestin蛋白亚基选自β-arrestin 1或β-arrestin 2中的一种，所述clathrin蛋白亚基选自clta或cltb中的一种；所述探针在活细胞中能够实时、动态检测β-arrestin与clathrin蛋白互作。

3、进一步，所述融合蛋白包括β-arrestin1_lgbit，核苷酸序列为seq id no .1、β-arrestin2_lgbit，核苷酸序列为seq id no .2、β-arrestin1_smbit，核苷酸序列为seq idno .3）、β-arrestin2_smbit，核苷酸序列为seq id no .4、lgbit_β-arrestin1，核苷酸序列为seq id no .5、lgbit_β-arrestin2，核苷酸序列为seq id no .6、smbit_β-arrestin1，核苷酸序列为seq id no .7、smbit_β-arrestin2，核苷酸序列为seq id no.8、clta_lgbit，核苷酸序列为seq id no .9、cltb_lgbit，核苷酸序列为seq id no .10、clta_smbit，核苷酸序列为seq id no .11、cltb_smbit，核苷酸序列为seq id no .12、lgbit_clta，核苷酸序列为seq id no .13、lgbit_cltb，核苷酸序列为seq id no .14、smbit_clta，核苷酸序列为seq id no .15和smbit_cltb，核苷酸序列为seq id no .16。

4、进一步，所述探针选自以下任意一种：

5、smbit_clta + β-arrestin1_lgbit；

6、smbit_clta + β-arrestin2_lgbit；

7、smbit_cltb + β-arrestin1_lgbit

8、smbit_cltb + β-arrestin2_lgbit；

9、clta_smbit + β-arrestin1_lgbit；

10、clta_smbit + β-arrestin2_lgbit；

11、cltb_smbit + β-arrestin1_lgbit；

12、cltb_smbit + β-arrestin2_lgbit；

13、smbit_clta + lgbit_β-arrestin1；

14、smbit_clta + lgbit_β-arrestin2；

15、smbit_cltb + lgbit_β-arrestin1；

16、smbit_cltb + lgbit_β-arrestin2；

17、clta_smbit + lgbit_β-arrestin1；

18、clta_smbit + lgbit_β-arrestin2；

19、cltb_smbit + lgbit_β-arrestin1；

20、cltb_smbit + lgbit_β-arrestin2；

21、lgbit_clta + β-arrestin1_smbit；

22、lgbit_clta + β-arrestin2_smbit；

23、lgbit_cltb + β-arrestin1_smbit；

24、lgbit_cltb + β-arrestin2_smbit；

25、clta_lgbit + β-arrestin1_smbit；

26、clta_lgbit + β-arrestin2_smbit；

27、cltb_lgbit + β-arrestin1_smbit；

28、cltb_lgbit + β-arrestin2_smbit；

29、lgbit_clta + smbit_β-arrestin1；

30、lgbit_clta + smbit_β-arrestin2；

31、lgbit_cltb + smbit_β-arrestin1；

32、lgbit_cltb + smbit_β-arrestin2；

33、clta_lgbit + smbit_β-arrestin1；

34、clta_lgbit + smbit_β-arrestin2；

35、、cltb_lgbit + smbit_β-arrestin1；

36、cltb_lgbit + smbit_β-arrestin2。

37、更进一步，所述荧光素酶互补探针选自smbit_clta + β-arrestin1_lgbit、smbit_clta + β-arrestin2_lgbit或clta_smbit + β-arrestin2_lgbit中的一种。

38、优选的，所述荧光素酶互补探针为smbit_clta + β-arrestin2_lgbit。

39、进一步，所述β-arrestin蛋白亚基和clathrin蛋白亚基与所述nanoluc荧光素酶小亚基之间通过linker连接。

40、更进一步，所述linker为柔性linker，其核苷酸序列如seq id no .17所示。

41、第二方面，本发明提供第一方面所述荧光素酶互补探针在制备药物筛选的试剂中的应用，所述药物筛选是将所述荧光素酶互补探针转染至细胞中，不同药物干预后的荧光信号强度与g蛋白偶联受体本身的激动剂的信号进行比对，通过分析探针信号随药物处理的上升或下降趋势，筛选可能作用于该受体该生理过程的药物；所述探针分别由两种融合蛋白组成，所述两种融合蛋白包括连接nanoluc荧光素酶小亚基的β-arrestin蛋白亚基和连接nanoluc荧光素酶小亚基的clathrin蛋白亚基，所述nanoluc荧光素酶小亚基选自smbit或lgbit中的一种，所述β-arrestin蛋白亚基选自β-arrestin 1或β-arrestin 2中的一种，所述clathrin蛋白亚基选自clta或cltb中的一种。

42、进一步，所述融合蛋白包括β-arrestin1_lgbit，核苷酸序列为seq id no .1、β-arrestin2_lgbit，核苷酸序列为seq id no .2、β-arrestin1_smbit，核苷酸序列为seq idno .3）、β-arrestin2_smbit，核苷酸序列为seq id no .4、lgbit_β-arrestin1，核苷酸序列为seq id no .5、lgbit_β-arrestin2，核苷酸序列为seq id no .6、smbit_β-arrestin1，核苷酸序列为seq id no .7、smbit_β-arrestin2，核苷酸序列为seq id no.8、clta_lgbit，核苷酸序列为seq id no .9、cltb_lgbit，核苷酸序列为seq id no .10、clta_smbit，核苷酸序列为seq id no .11、cltb_smbit，核苷酸序列为seq id no .12、lgbit_clta，核苷酸序列为seq id no .13、lgbit_cltb，核苷酸序列为seq id no .14、smbit_clta，核苷酸序列为seq id no .15和smbit_cltb，核苷酸序列为seq id no .16。

43、进一步，所述探针选自以下任意一种：

44、smbit_clta + β-arrestin1_lgbit；

45、smbit_clta + β-arrestin2_lgbit；

46、smbit_cltb + β-arrestin1_lgbit

47、smbit_cltb + β-arrestin2_lgbit；

48、clta_smbit + β-arrestin1_lgbit；

49、clta_smbit + β-arrestin2_lgbit；

50、cltb_smbit + β-arrestin1_lgbit；

51、cltb_smbit + β-arrestin2_lgbit；

52、smbit_clta + lgbit_β-arrestin1；

53、smbit_clta + lgbit_β-arrestin2；

54、smbit_cltb + lgbit_β-arrestin1；

55、smbit_cltb + lgbit_β-arrestin2；

56、clta_smbit + lgbit_β-arrestin1；

57、clta_smbit + lgbit_β-arrestin2；

58、cltb_smbit + lgbit_β-arrestin1；

59、cltb_smbit + lgbit_β-arrestin2；

60、lgbit_clta + β-arrestin1_smbit；

61、lgbit_clta + β-arrestin2_smbit；

62、lgbit_cltb + β-arrestin1_smbit；

63、lgbit_cltb + β-arrestin2_smbit；

64、clta_lgbit + β-arrestin1_smbit；

65、clta_lgbit + β-arrestin2_smbit；

66、cltb_lgbit + β-arrestin1_smbit；

67、cltb_lgbit + β-arrestin2_smbit；

68、lgbit_clta + smbit_β-arrestin1；

69、lgbit_clta + smbit_β-arrestin2；

70、lgbit_cltb + smbit_β-arrestin1；

71、lgbit_cltb + smbit_β-arrestin2；

72、clta_lgbit + smbit_β-arrestin1；

73、clta_lgbit + smbit_β-arrestin2；

74、、cltb_lgbit + smbit_β-arrestin1；

75、cltb_lgbit + smbit_β-arrestin2。

76、更进一步，所述荧光素酶互补探针选自smbit_clta + β-arrestin1_lgbit、smbit_clta + β-arrestin2_lgbit或clta_smbit + β-arrestin2_lgbit中的一种。

77、优选的，所述荧光素酶互补探针为smbit_clta + β-arrestin2_lgbit。

78、进一步，所述β-arrestin蛋白亚基和clathrin蛋白亚基与所述nanoluc荧光素酶小亚基之间通过linker连接。

79、更进一步，所述linker为柔性linker，其核苷酸序列如seq id no .17所示。

80、有益效果

81、本发明提供的荧光素酶互补探针与现有技术相比至少具有如下有益效果：

82、本发明提供的荧光互补探针具有良好的信号响应与信噪比，可用于高通量筛选；

83、本发明提供的探针集具有良好的稳定性，达到信号最大值后，不会直接急速下降，而是逐步衰减或稳定，证明探针的稳定性高；

84、适用于活细胞实时检测：该探针可在活细胞中连续记录发光信号，获得β-arrestin/clathrin 互作的时间动力学曲线；

85、具有较高时间分辨率：探针可在激动剂刺激后短时间内产生响应，适合研究内化早期事件；

86、可获得药理学参数：该探针能够绘制激动剂浓度依赖曲线，并计算ec50、emax和auc等药理学指标。