一种用于评估HIV感染者抗逆转录病毒治疗后免疫重建不全风险的方法及试剂盒与流程

本发明属于生物医学检测，具体是一种用于评估hiv感染者抗逆转录病毒治疗后免疫重建不全风险的方法及试剂盒。

背景技术：

1、获得性免疫缺陷综合征（aids，艾滋病）是由人类免疫缺陷病毒（hiv）感染引起的严重传染性疾病，其核心病理特征为hiv特异性攻击cd4+t淋巴细胞，导致机体免疫功能进行性受损。高效抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy，art）的广泛应用已使hiv感染从致死性疾病转变为可控制的慢性疾病，绝大多数患者经规范art治疗后可实现持续病毒学抑制，即血浆病毒载量低于检测下限。

2、然而，临床实践中发现，约有10%~40%的hiv感染者即使在接受art治疗后实现了长期病毒学抑制，其cd4+t细胞计数仍无法恢复至正常水平，这种现象被称为免疫重建不全（incomplete immune reconstitution，iir）或免疫无应答（immunological non-responder，inr）。免疫重建不全患者面临更高的机会性感染风险、肿瘤发生风险及非艾滋病相关并发症（如心血管疾病、肝肾疾病、骨质疏松等）的发生率，其总体死亡率显著高于免疫重建良好的患者，已成为当前hiv临床管理中的重要挑战。

3、目前，临床上对免疫重建不全的判断主要依赖art治疗后的cd4+t细胞计数随访监测，通常需要经过2年甚至更长时间的治疗随访后才能明确患者是否属于免疫重建不全。常用的免疫重建不全判定标准包括：接受art治疗至少2年、持续病毒学抑制，且cd4+t细胞计数持续低于350 cells/μl或400 cells/μl等。然而，这种事后判定模式存在明显的临床局限性，当医生确认患者为免疫重建不全时，患者往往已经历了数年的免疫恢复不良过程，错过了早期干预的最佳时机。

4、现有研究表明，基线cd4+t细胞计数是预测免疫重建结局最常用的临床指标，基线cd4+t细胞水平越低，后续发生免疫重建不全的风险越高。然而，大量临床观察发现，即使基线cd4+t细胞计数相近的患者，其长期免疫恢复结局也可能存在显著差异，部分基线 cd4+t细胞水平较高的患者仍可能发生免疫重建不全，而部分基线水平较低的患者却能实现良好的免疫恢复。这说明，单纯依赖基线cd4+t细胞计数无法准确预测个体的免疫重建结局，其预测效能有限。

5、为寻找更有效的预测指标，研究者们探索了多种候选生物标志物，包括：

6、（1）免疫活化指标，如cd8+t细胞活化标志物cd38/hla-dr的表达水平、血浆炎症因子（如 il-6、tnf-α、scd14 等）浓度；

7、（2）胸腺功能指标，如t细胞受体切除环（trecs）水平、近期胸腺输出功能等；

8、（3）细胞衰老与凋亡指标，如端粒长度、pd-1表达水平等；

9、（4）宿主遗传因素，如hla基因型、ccr5δ32 突变等。

10、尽管上述标志物在部分研究中显示出与免疫重建结局的一定相关性，但截至目前，尚未有任何单一标志物或标志物组合被广泛认可并应用于临床常规检测。现有标志物一是预测准确性有限，多数单一标志物的auc（受试者工作特征曲线下面积）难以达到临床应用所需的高灵敏度和高特异度；二是检测流程复杂、成本较高，部分指标需要流式细胞术等专业设备和技术，难以在基层医疗机构推广；三是缺乏在多中心、独立队列中的充分验证，不同研究结果的一致性较差，泛化能力不足。

11、因此，有必要提出一种能够在art启动前准确预测hiv感染者后续免疫重建结局、检测靶标少、检测方法简便且经多队列验证的免疫重建不全风险检测方法和试剂盒，以实现对高风险患者的早期识别和精准管理，为临床干预决策提供科学依据。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于评估hiv感染者抗逆转录病毒治疗后免疫重建不全风险的方法及试剂盒，通过筛选并验证ltbp3、polr2j3和trabd2a三个核心靶标基因，构建了可在抗逆转录病毒治疗启动前即预测hiv感染者后续免疫重建不全风险的三基因联合检测模型，不仅将风险识别窗口从治疗后2年以上提前至治疗启动前，为高风险患者的早期随访管理和干预争取了时间，而且在基线cd4+t细胞水平相近的人群中仍保持auc达0.986的高区分能力，提供了传统临床指标之外的独立预测信息，且该模型在多个独立验证队列和外部数据集中具备一定的跨人群泛化能力，三个靶标基因分别涉及wnt信号调控、tgf-β通路调节及宿主转录调控等生物学过程，兼具机制研究价值与干预靶点筛选潜力，可为hiv免疫重建不全的精准分层管理和后续机制探索提供双重支撑。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种用于预测hiv感染者抗逆转录病毒治疗后免疫重建不全风险的检测方法，包括以下步骤：

3、（1）获取hiv感染者抗逆转录病毒治疗启动前的外周血单个核细胞样本，提取总rna并逆转录为cdna；

4、（2）检测所述cdna中ltbp3、polr2j3和trabd2a三个目标基因的表达水平；

5、（3）以内参基因对三个目标基因的表达水平进行标准化，将标准化后的表达值输入预先构建的免疫重建不全风险预测模型中，计算得到待测个体发生免疫重建不全的风险概率；

6、（4）将所述风险概率与预设阈值比较，输出待测个体的免疫重建不全风险等级。

7、本发明的基本原理在于：hiv感染者接受art治疗后的免疫重建结局并非单纯取决于基线cd4+t细胞水平，而是与治疗启动前宿主免疫细胞的整体转录状态、信号通路活化程度及免疫调控网络的稳态密切相关。免疫重建不全的发生是一个多因素、多通路参与的复杂病理过程，单一指标往往难以全面反映宿主的免疫恢复潜能，因此需要从转录组层面筛选一组能够独立于基线cd4+t细胞水平、且共同反映免疫重建关键生物学过程的基因组合，通过多基因联合检测实现对免疫重建结局的精准预测。本发明通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析及lasso逻辑回归等多步生物信息学筛选策略，并结合独立队列验证，最终确定ltbp3、polr2j3和trabd2a三个基因为核心检测靶标，三者分别从不同的生物学维度参与免疫重建过程的调控，其表达水平的联合检测能够提供互补性的预测信息，从而显著提高风险评估的准确性和稳定性。

8、trabd2a，又称tiki1，是一种含trab结构域的金属蛋白酶，既往研究已证实其在胚胎发育及wnt信号通路调控中发挥重要作用。本发明选择trabd2a作为核心靶基因之一，首先是基于其在免疫重建不全患者中呈现稳定且显著的下调表达，该趋势在训练队列、独立验证队列及rt-qpcr、western blot实验验证中均保持一致，具有良好的可重复性。更为重要的是，wnt信号通路在t细胞存活、干性维持、记忆细胞形成及免疫稳态调控中具有不可替代的作用，其持续下调可能直接影响cd4+t细胞的增殖分化能力和长期免疫重建效果。gsea分析结果表明，免疫重建不全患者外周血单个核细胞（pbmc）中wnt信号通路整体呈下调状态，尽管trabd2a本身被认为是wnt信号通路的负向调控因子，其表达降低理论上应解除对wnt活性的抑制，但在hiv感染及慢性炎症背景下，持续性病毒复制、慢性免疫激活及炎症微环境等因素可能直接抑制wnt通路关键分子的表达，从而覆盖trabd2a表达下降所产生的调控效应，使得trabd2a表达降低成为一种代偿性但不足以恢复wnt通路活性的分子反应。此外，trabd2a还被报道具有hiv限制因子功能，可通过促进质膜处病毒gag蛋白降解而抑制hiv产生，其表达降低可能削弱宿主对病毒产生的限制作用，进而促进感染细胞或病毒储存库的持续存在，这一功能将wnt信号调控、免疫恢复障碍及hiv病毒储存库维持三者联系在一起，使trabd2a成为连接免疫重建病理机制与病毒学控制的关键节点分子，具备重要的生物学意义和机制研究价值。

9、ltbp3即潜伏型转化生长因子β结合蛋白3，是潜伏tgf-β结合蛋白家族的重要成员，主要参与成熟tgf-β的分泌、细胞外基质储存及活化调控，在免疫稳态维持、炎症反应调节和组织微环境重塑中发挥核心作用。本发明选择ltbp3作为靶基因，一方面是因为其在免疫重建不全患者中的下调趋势在转录组测序和实验验证中均具有较好的一致性，统计稳定性高；另一方面，tgf-β信号通路是调控t细胞分化、功能和稳态的关键通路之一，其与cd4+t细胞的亚群分化、免疫抑制微环境形成、炎症反应调控及病毒储存库的反应性密切相关。既往研究已提示ltbp3是参与hiv-1感染相关免疫调控的候选基因，其在hiv感染者中的表达水平低于hiv阴性个体，而本发明进一步发现，在hiv感染者群体内部，ltbp3的表达水平与免疫重建结局显著相关，免疫重建不全患者的ltbp3表达水平更低。ltbp3作为 tgf-β通路的上游调控分子，其表达降低可能直接影响tgf-β的分泌、储存和活化效率，进而改变tgf-β信号通路的活化状态，影响cd4+t细胞的分化方向和免疫重建进程。ltbp3-tgf-β轴的异常可能通过调控treg细胞功能、th17细胞分化及炎症因子分泌等多个环节参与免疫重建不全的发生发展，这一通路的明确生物学功能为ltbp3作为预测标志物提供了坚实的机制基础，也为后续探索靶向干预策略提供了潜在的作用靶点。

10、polr2j3是rna聚合酶ii复合体的相关亚基，参与真核生物基因转录的起始和延伸过程，是宿主基因转录调控网络的重要组成部分。本发明选择polr2j3作为三基因联合模型的组成指标，主要基于以下考虑：尽管polr2j3在hiv感染和免疫重建中的具体作用机制尚未完全阐明，但其在训练队列和独立验证队列的免疫重建不全患者中均呈现稳定的下调趋势，这种跨队列的一致性变化提示其表达水平与宿主免疫恢复结局之间存在真实的生物学关联。虽然polr2j3在rt-qpcr验证中的差异未达到统计学显著性，且单独用于预测时的效能低于另外两个基因，但这并不影响其作为联合模型组成部分的价值，rna聚合酶ii亚基的表达变化可能反映宿主细胞整体转录活性的改变，而hiv感染后宿主转录调控网络的重塑程度与免疫细胞功能状态密切相关，polr2j3的表达水平可能从全局转录调控的角度反映art启动前宿主免疫细胞的转录状态和功能潜能。将polr2j3纳入联合模型，能够补充另外两个基因所代表的信号通路层面之外的转录调控维度信息，与ltbp3代表的tgf-β通路、trabd2a代表的wnt通路及病毒限制功能形成互补，使三基因模型能够从不同生物学层面综合反映宿主的免疫状态，从而提高模型的整体预测性能和稳定性。

11、三个基因的选择经过严格的多步筛选和多维度验证，确保其既具有统计学上的稳健性，又具备生物学上的合理性。从实验流程来看，三个基因均同时满足差异表达显著、属于与免疫重建不全表型相关的共表达模块、经lasso回归特征筛选保留、在独立验证队列中趋势稳定等多重条件，最大程度降低了假阳性发现的风险。从生物学功能来看，三个基因分别代表了不同的调控层面，trabd2a连接wnt信号通路与hiv限制功能，ltbp3调控tgf-β介导的免疫稳态与炎症反应，polr2j3反映宿主全局转录调控状态，三者从不同角度共同刻画了art启动前宿主免疫细胞的分子状态，其表达组合能够提供比任何单一基因更全面、更稳定的预测信息。这种多维度、互补性的基因组合设计，既保证了模型的预测准确性，又为后续深入阐明免疫重建不全的发生机制提供了多条潜在的研究线索，使本发明不仅具有临床应用价值，还具备重要的科学研究意义。

12、本技术方案的研发过程：1.研究对象的纳入与分组

13、1.1研究对象

14、本研究共纳入72例在某三甲医院感染科就诊的hiv感染者，所有患者均符合以下纳入标准：（1）经hiv抗体确证试验阳性的hiv-1感染者；（2）首次启动art治疗；（3）接受art治疗时间≥2年；（4）art治疗后至少连续12个月血浆hiv rna载量＜50 copies/ml，即达到持续病毒学抑制；（5）具有完整的临床随访资料和art启动前留存的 pbmc样本。

15、排除标准：（1）合并乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或其他严重感染性疾病者；（2）合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病或严重肝肾功能不全者；（3）接受过免疫抑制剂或糖皮质激素长期治疗者；（4）临床资料不完整者。

16、1.2分组标准

17、根据接受art治疗至少2年后的 cd4+t 细胞恢复情况，将患者分为两组：

18、免疫重建不全组（iir组）：接受art治疗≥2 年、持续病毒学抑制，且cd4+t细胞计数持续低于350 cells/μl 的患者，共34例。

19、免疫重建良好组（cir组）：接受art治疗≥2年、持续病毒学抑制，且至少两次随访中cd4+t细胞计数≥500 cells/μl 的患者，共38例。

20、1.3队列划分

21、采用随机数字表法将72例患者划分为训练队列和验证队列：

22、训练队列：共34例，其中iir组18例，cir组16例。训练队列中两组患者按性别、年龄和art启动前基线cd4+t细胞计数进行1:1倾向性匹配，以尽量减少基线cd4+t细胞水平对后续模型筛选的影响，如表1所示。

23、表1.训练队列患者基线特征表

24、

25、验证队列：共38例，其中iir组16例，cir组18例，作为独立验证队列用于评估模型的泛化能力，如表2所示。

26、表2.验证队列患者基线特征表

27、

28、本研究经医院伦理委员会审查批准，所有研究对象均签署知情同意书。研究技术路线流程如图1所示。

29、2.pbmc分离与rna提取及转录组测序

30、2.1主要试剂与仪器

31、淋巴细胞分离液（密度梯度离心法，ficoll-paque plus）；trizol试剂；柱式总rna提取试剂盒；超微量分光光度计（nanodrop 2000）；生物分析仪（agilent 2100bioanalyzer）；illumina novaseq 6000 测序平台。

32、2.2 pbmc分离

33、采集hiv感染者art启动前的edta抗凝外周静脉血10 ml，采用密度梯度离心法分离pbmc：将抗凝全血与等体积pbs缓冲液轻轻混匀，沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上方，400×g室温离心30 min。吸取中间白膜层细胞，加入pbs缓冲液洗涤2次，250×g 离心10 min，弃上清，获得pbmc沉淀。所得pbmc一部分直接用于rna提取，另一部分加入含10%dmso的胎牛血清冻存液，程序降温后置于液氮中保存备用。

34、2.3总rna提取

35、向pbmc沉淀中加入1 ml trizol试剂，反复吹打至细胞完全裂解，室温静置5 min；加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置3 min；4℃、12000×g离心 15 min，吸取上层水相至新的无rnase离心管中；加入等体积75%乙醇，混匀后转移至柱式rna提取试剂盒的吸附柱中，按试剂盒说明书进行洗涤和洗脱，最终获得总rna。

36、2.4 rna质量检测

37、采用超微量分光光度计测定rna浓度及a260/a280 比值，要求a260/a280≥1.8；采用生物分析仪测定rna完整性，要求rin值≥7.0。用于转录组测序的rna样本还需满足总rna量≥500 ng、浓度≥50 ng/μl。

38、2.5转录组测序

39、取质检合格的总rna样本，采用mrna富集法构建测序文库，经片段化、逆转录、末端修复、加a尾、连接接头、pcr扩增等步骤制备cdna文库。文库质检合格后，送生物公司测序。

40、3.差异表达基因筛选与加权基因共表达网络分析

41、3.1差异表达基因分析

42、基于训练队列的转录组测序数据，采用limma包进行免疫重建不全组与免疫重建良好组之间的差异表达分析。筛选标准为：校正后p值＜0.01，且| log2（倍数变化）|≥log21.5（即绝对倍数变化≥1.5）。

43、实验结果：

44、经差异表达分析，共获得378个差异表达基因，其中161个基因在免疫重建不全组中表达上调，217个基因表达下调。上述差异基因为后续筛选免疫重建不全相关的核心标志物提供了候选范围。

45、3.2加权基因共表达网络分析（wgcna）

46、采用wgcna r包对训练队列中所有表达基因进行加权基因共表达网络分析。首先对基因表达矩阵进行预处理，过滤低表达基因；然后计算基因间的pearson相关系数，选择合适的软阈值构建邻接矩阵，并进一步转化为拓扑重叠矩阵；采用平均连锁层次聚类法对基因进行聚类，结合动态剪切树算法识别基因模块，将模块特征基因与免疫重建不全表型、基线 cd4+t细胞计数等临床性状进行关联分析。

47、实验结果：

48、wgcna分析共识别出多个基因共表达模块，其中meblue模块与免疫重建不全表型呈显著相关（p＜0.01），但与art启动前基线cd4+t细胞计数无显著相关性（p＞0.05）。该结果提示，meblue模块所反映的生物学特征并不完全依赖于基线 cd4+t细胞水平，可能包含独立于基线免疫状态的免疫重建预测信息。wgcna分析结果如图 2所示。

49、3.3候选基因的交集筛选

50、将3.1节获得的378个差异表达基因与meblue模块中与免疫重建不全表型显著相关的基因取交集，共获得55个候选基因。这些基因既在两组间存在显著表达差异，又属于与免疫重建不全表型相关的共表达模块，且其表达变化不依赖于基线cd4+t细胞水平，是构建免疫重建不全预测模型的理想候选基因。

51、4.lasso逻辑回归筛选预测基因

52、4.1 lasso回归分析

53、以55个候选基因的标准化表达值为自变量，以免疫重建不全/良好的二分类结局为因变量，采用glmnet r包进行lasso逻辑回归分析。通过10折交叉验证选择最优λ值，在该λ值下模型具有最小的交叉验证误差。

54、4.2候选基因的初步筛选

55、在最优λ值下，lasso回归对基因系数进行压缩，将部分不重要基因的系数压缩至0，最终保留系数非零的基因作为初步筛选的预测基因。

56、实验结果：

57、经lasso逻辑回归分析，最终筛选得到6个候选基因，分别为fbxo16、gba1、linc0187、ltbp3、polr2j3和trabd2a。lasso回归的系数分布曲线、交叉验证误差曲线及6个基因的系数柱状图如图3a、3b和3c所示。

58、4.3独立验证队列中的验证

59、为进一步确认上述6个候选基因的稳定性，在独立验证队列（16例iir、18例cir）中，采用转录组测序数据检测各基因的表达水平，比较两组间的表达差异。

60、实验结果：

61、在独立验证队列中，ltbp3、polr2j3和trabd2a三个基因均保持与训练队列一致的差异表达趋势，即在免疫重建不全组中表达显著降低（p＜0.05）；而fbxo16、gba1和linc0187三个基因在验证队列中未显示出稳定的组间差异或差异趋势不一致。因此，最终选择ltbp3、polr2j3和trabd2a三个基因构建三基因联合预测模型。验证队列中三个基因的表达箱线图如图4a和4b所示。

62、5.三基因联合预测模型的构建与性能评估

63、5.1模型构建

64、基于训练队列中ltbp3、polr2j3和trabd2a三个基因的标准化表达值（fpkm 值经log2转化），采用多因素逻辑回归构建免疫重建不全风险预测模型。模型的线性预测值（lp）计算公式如下：

65、lp = 16.323124+1.875113×ltbp3−1.535914×polr2j3−3.590095×trabd2a；免疫重建不全的预测概率p为：p=1/[1+exp(−lp)]。

66、5.2最佳阈值确定

67、基于训练队列的预测概率，绘制受试者工作特征（roc）曲线，计算曲线下面积（auc），并采用最大youden指数（youden指数=灵敏度+特异度−1）确定最佳风险阈值。

68、实验结果：

69、经计算，最佳概率阈值为0.723。当p≥0.723时，判定待测对象为art后发生免疫重建不全的高风险个体；当p＜0.723时，判定为低风险个体。在该阈值下，模型在训练队列中的灵敏度为83.3%，特异度为100.0%。

70、5.3列线图模型构建

71、基于训练队列的三基因逻辑回归模型，构建列线图（nomogram）可视化预测模型。该列线图将ltbp3、polr2j3和trabd2a各基因的表达水平分别转换为对应的评分，各基因评分累加得到总评分，并根据总评分在底部标尺上读取个体发生免疫重建不全的预测概率。

72、实验结果：

73、构建的三基因列线图模型如图5所示。该模型可直观展示各基因对免疫重建不全风险的贡献程度，便于临床医生快速计算患者的风险概率。

74、进一步，步骤（2）中所述表达水平的检测方法为实时荧光定量pcr法、数字pcr法、基因芯片法或rna测序法中的任意一种；所述内参基因为gapdh，采用t法、法或法对目标基因的表达水平进行标准化。

75、进一步，采用实时荧光定量pcr法检测时，目标基因的特异性引物对序列如下：

76、ltbp3：正向引物序列如seq id no:1所示，反向引物序列如seq id no:2所示；

77、polr2j3：正向引物序列如seq id no:3所示，反向引物序列如seq id no:4所示；

78、trabd2a：正向引物序列如seq id no:5所示，反向引物序列如seq id no:6所示；

79、gapdh：正向引物序列如seq id no:7所示，反向引物序列如seq id no:8所示。

80、进一步，步骤（3）中所述风险预测模型为逻辑回归模型，其线性预测值lp的计算公式为：

81、，

82、其中，a为常数项，、、分别为三个目标基因对应的回归系数；

83、免疫重建不全的风险概率p满足：。

84、进一步，所述常数项a=16.323124，=1.875113，=−1.535914，=−3.590095；

85、步骤（4）中所述预设阈值为0.723，当p≥0.723时判定待测个体为免疫重建不全高风险，当p＜0.723时判定为低风险。

86、进一步，所述免疫重建不全的定义为：接受抗逆转录病毒治疗至少2年、持续病毒学抑制且cd4+t细胞计数持续低于350 cells/μl；

87、所述免疫重建良好的定义为：接受抗逆转录病毒治疗至少2年、持续病毒学抑制且至少两次随访cd4+t细胞计数≥500 cells/μl。

88、进一步，步骤（3）的风险预测模型还联合基线cd4+t细胞计数、年龄、cd4+/cd8+t细胞比值、病毒载量或炎症指标中的至少一项临床参数，构建联合风险评估模型。

89、一种用于上述预测hiv感染者抗逆转录病毒治疗后免疫重建不全风险检测方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含特异性检测ltbp3、polr2j3和trabd2a三个目标基因表达水平的试剂，以及内参基因gapdh的检测试剂。

90、进一步，所述试剂盒为实时荧光定量pcr试剂盒、数字pcr试剂盒、多重pcr试剂盒或微流控芯片试剂盒；所述检测试剂包括各基因的特异性引物对和/或特异性荧光探针。

91、上述ltbp3、polr2j3和trabd2a基因组合在制备用于预测hiv感染者抗逆转录病毒治疗后免疫重建不全风险的检测试剂盒或检测方法中的应用。

92、本发明的有益效果在于：（1）现有技术需在art治疗2年以上、经多次随访确认cd4+t细胞持续低水平后方可判定免疫重建不全，本技术方案利用art启动前pbmc中的三基因表达信息即可完成风险评估，将风险识别节点从治疗后长期随访确认提前至治疗启动前，为高风险患者的早期随访管理、免疫监测和干预策略制定争取了关键时间窗口。

93、（2）训练队列中两组患者经基线cd4+t细胞匹配后，三基因联合模型的auc仍高达0.986，而单独使用基线cd4+t细胞计数的auc仅为0.674，说明三基因特征反映的是独立于基线免疫水平的宿主免疫重建潜能信息，能够有效区分基线cd4+t细胞相近但长期免疫恢复结局不同的患者群体，弥补了现有临床指标预测能力不足的缺陷。

94、（3）在训练队列中，polr2j3、trabd2a、ltbp3单基因预测的auc分别为0.913、0.882、0.872，而三基因联合模型的auc达到 0.986，灵敏度83.3%，特异度100.0%，c-index为0.986。多基因联合可减少单一指标波动对结果的影响，从wnt通路调控、tgf-β免疫稳态、宿主转录调控等多个维度综合评估免疫重建风险，显著提高预测的准确性和稳定性。

95、（4）三基因模型不仅在独立验证队列中保持auc=0.892的良好区分能力，在训练与验证合并队列中auc为0.850（优于基线cd4+t细胞的0.796），还在tang队列、gse106792、gse143742、gse77939等4个外部独立数据集中均验证有效，auc范围为0.757~0.929，表明该模型在不同art治疗人群中具有良好的可重复性和跨人群泛化能力。

96、（5）从全转录组数千个基因中最终精简至仅3个核心检测靶标，无需进行高成本、复杂的rna测序，采用常规rt-qpcr、数字pcr或多重pcr即可完成检测，检测成本低、操作流程简便、周期短，且不同实验室间易实现检测流程标准化，有利于向临床实验室和基层医疗机构推广应用。