一种CCR8突变体及其应用的制作方法

本技术属于生物医药，涉及一种ccr8突变体及其应用。

背景技术：

1、ccr8（cc趋化因子受体8，cc chemokine receptor 8）属于g蛋白偶联受体家族（gpcr，g protein-coupled receptor）。g蛋白偶联受体是一类具有七次跨膜结构的膜蛋白，参与多种信号传导过程，是肿瘤免疫微环境中调节性t细胞（tregs，regulatory tcells）的关键特异性靶点。针对其筛选的临床大分子抗体多高度依赖受体在天然脂质双分子层中形成的极其复杂的三维构象。然而，作为多次跨膜蛋白，野生型ccr8具有极强的疏水性，在体外异源细胞表达系统中极易发生错误折叠导致上膜表达量极低。

2、为提升gpcr的异源表达稳定性，本领域已尝试基于ballesteros-weinstein（bw）编号系统与同源受体映射规律，引入常规稳定化突变。然而，将这些常规突变简单叠加至人源ccr8上，虽能勉强维持基础构象，但表达丰度仍远达不到工业级抗体药物筛选所需的水平。现有技术中缺乏既能实现高丰度展示，又能完美保留受体天然抗原表位的重组蛋白工具，严重制约了抗ccr8靶向药物的研发进度。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本技术的目的在于提供一种ccr8突变体及其应用。

2、为达到此申请目的，本技术采用以下技术方案：

3、第一方面，本技术提供一种ccr8突变体，所述ccr8突变体的氨基酸序列为在seqid no:1所示序列的基础上突变获得的氨基酸序列，所述突变为i69a、q277a和i287a；

4、或者，所述突变为i69a、q277a、i287a、c63y、l168n、a236d和k306e。

5、本技术在特定位点进行氨基酸的突变（i69a、q277a、i287a），跨膜螺旋（tm）内部的异亮氨酸（i69、i287）侧链较大，易引起螺旋间堆叠的物理排斥；谷氨酰胺（q277）作为极性残基深埋于疏水核心，易造成高能态的折叠不稳定。将上述位点精确替换为具有极高α-螺旋倾向性且侧链极小的丙氨酸（alanine），有效解除了螺旋间的空间位阻，并消除了局部的极性微环境缺陷，极大地降低了受体的折叠自由能。

6、seq id no:1：

7、mdytldlsvttvtdyyypdifsspcdaeliqtngklllavfycllfvfsllgnslvilvlvvckklrsitdvyllnlalsdllfvfsfpfqtyylldqwvfgtvmckvvsgfyyigfyssmffitlmsvdrylavvhavyalkvrtirmgttlclavwltaimatipllvfyqvasedgvlqcysfynqqtlkwkiftnfkmnilgllipftifmfcyikilhqlkrcqnhnktkairlvlivviasllfwvpfnvvlfltslhsmhildgcsisqqltyathvteiisfthccvnpviyafvgekfkkhlseifqkscsqifnylgrqmprescekssscqqhssrsssvdyil。

8、在一些实施方式中，所述编码ccr8的核苷酸序列包括如seq id no:5所示的序列。

9、seq id no:5：

10、atggattatacacttgacctcagtgtgacaacagtgaccgactactactaccctgatatcttctcaagcccctgtgatgcggaacttattcagacaaatggcaagttgctccttgctgtcttttattgcctcctgtttgtattcagtcttctgggaaacagcctggtcatcctggtccttgtggtctgcaagaagctgaggagcatcacagatgtatacctcttgaacctggccctgtctgacctgctttttgtcttctccttcccctttcagacctactatctgctggaccagtgggtgtttgggactgtaatgtgcaaagtggtgtctggcttttattacattggcttctacagcagcatgtttttcatcaccctcatgagtgtggacaggtacctggctgttgtccatgccgtgtatgccctaaaggtgaggacgatcaggatgggcacaacgctgtgcctggcagtatggctaaccgccattatggctaccatcccattgctagtgttttaccaagtggcctctgaagatggtgttctacagtgttattcattttacaatcaacagactttgaagtggaagatcttcaccaacttcaaaatgaacattttaggcttgttgatcccattcaccatctttatgttctgctacattaaaatcctgcaccagctgaagaggtgtcaaaaccacaacaagaccaaggccatcaggttggtgctcattgtggtcattgcatctttacttttctgggtcccattcaacgtggttcttttcctcacttccttgcacagtatgcacatcttggatggatgtagcataagccaacagctgacttatgccacccatgtcacagaaatcatttcctttactcactgctgtgtgaaccctgttatctatgcttttgttggggagaagttcaagaaacacctctcagaaatatttcagaaaagttgcagccaaatcttcaactacctaggaagacaaatgcctagggagagctgtgaaaagtcatcatcctgccagcagcactcctcccgttcctccagcgtagactacattttgtaa。

11、在跨膜区疏水核心或第八螺旋（helix 8）引入特定突变以提升基础稳定性，具体而言，c63y属于跨膜区芳香环空间填补策略；l168n属于极性网络重构策略；a236d属于螺旋构象稳固策略；k306e则属于胞内侧电荷反转锚定锁。

12、i69a、q277a、i287a的突变与c63y、l168n、a236d、k306e的突变产生了意想不到的内部空间结构协同重排效应，在空间物理分布上形成了完美的互补。c63y、l168n、a236d、k306e的突变提供了受体全局的刚性支撑，而i69a、q277a、i287a则像“微观楔子”一样精准填补了底盘框架内部的疏水堆叠空隙。这种“内刚外柔”的协同重排，不仅使得重组受体能够顺利通过宿主细胞的折叠质控系统，实现细胞膜表面丰度的指数级跃升；同时使得受体胞外环（ecl）区域的相对空间位置得以绝对固定，从而完美保留了供参比抗体imzokitug识别的天然复杂构象。

13、流式细胞鉴定及对比实验证实，上述突变使得靶点在细胞膜上的展示丰度（总表达量）相较于野生型基准以及仅含c63y、l168n、a236d、k306e突变的改良序列发生了显著提升，克服了现有技术中ccr8及其普通突变序列在体外异源表达系统中极易错误折叠、低丰度及易降解的行业瓶颈问题。

14、在一些实施方式中，所述ccr8突变体的氨基酸序列为seq id no:3所示的序列。

15、seq id no:3：

16、mdytldlsvttvtdyyypdifsspcdaeliqtngklllavfycllfvfsllgnslvilvlvvckklrsatdvyllnlalsdllfvfsfpfqtyylldqwvfgtvmckvvsgfyyigfyssmffitlmsvdrylavvhavyalkvrtirmgttlclavwltaimatipllvfyqvasedgvlqcysfynqqtlkwkiftnfkmnilgllipftifmfcyikilhqlkrcqnhnktkairlvlivviasllfwvpfnvvlfltslhsmhildgcsisqaltyathvteaisfthccvnpviyafvgekfkkhlseifqkscsqifnylgrqmprescekssscqqhssrsssvdyil。

17、在一些实施方式中，所述编码ccr8突变体的核苷酸序列包括如seq id no:7所示的序列。

18、seq id no:7：

19、atggattatacacttgacctcagtgtgacaacagtgaccgactactactaccctgatatcttctcaagcccctgtgatgcggaacttattcagacaaatggcaagttgctccttgctgtcttttattgcctcctgtttgtattcagtcttctgggaaacagcctggtcatcctggtccttgtggtctgcaagaagctgaggagcgcgacagatgtatacctcttgaacctggccctgtctgacctgctttttgtcttctccttcccctttcagacctactatctgctggaccagtgggtgtttgggactgtaatgtgcaaagtggtgtctggcttttattacattggcttctacagcagcatgtttttcatcaccctcatgagtgtggacaggtacctggctgttgtccatgccgtgtatgccctaaaggtgaggacgatcaggatgggcacaacgctgtgcctggcagtatggctaaccgccattatggctaccatcccattgctagtgttttaccaagtggcctctgaagatggtgttctacagtgttattcattttacaatcaacagactttgaagtggaagatcttcaccaacttcaaaatgaacattttaggcttgttgatcccattcaccatctttatgttctgctacattaaaatcctgcaccagctgaagaggtgtcaaaaccacaacaagaccaaggccatcaggttggtgctcattgtggtcattgcatctttacttttctgggtcccattcaacgtggttcttttcctcacttccttgcacagtatgcacatcttggatggatgtagcataagccaagcgctgacttatgccacccatgtcacagaagcgatttcctttactcactgctgtgtgaaccctgttatctatgcttttgttggggagaagttcaagaaacacctctcagaaatatttcagaaaagttgcagccaaatcttcaactacctaggaagacaaatgcctagggagagctgtgaaaagtcatcatcctgccagcagcactcctcccgttcctccagcgtagactacattttgtaa。

20、在一些实施方式中，所述ccr8突变体的氨基酸序列为seq id no:4所示的序列。

21、seq id no:4：

22、mdytldlsvttvtdyyypdifsspcdaeliqtngklllavfycllfvfsllgnslvilvlvvykklrsatdvyllnlalsdllfvfsfpfqtyylldqwvfgtvmckvvsgfyyigfyssmffitlmsvdrylavvhavyalkvrtirmgttlclavwltaimatipnlvfyqvasedgvlqcysfynqqtlkwkiftnfkmnilgllipftifmfcyikilhqlkrcqnhnktkdirlvlivviasllfwvpfnvvlfltslhsmhildgcsisqaltyathvteaisfthccvnpviyafvgeefkkhlseifqkscsqifnylgrqmprescekssscqqhssrsssvdyil。

23、在一些实施方式中，所述编码ccr8突变体的核苷酸序列包括如seq id no:8所示的序列。

24、seq id no:8：

25、atggattatacacttgacctcagtgtgacaacagtgaccgactactactaccctgatatcttctcaagcccctgtgatgcggaacttattcagacaaatggcaagttgctccttgctgtcttttattgcctcctgtttgtattcagtcttctgggaaacagcctggtcatcctggtccttgtggtctataagaagctgaggagcgcgacagatgtatacctcttgaacctggccctgtctgacctgctttttgtcttctccttcccctttcagacctactatctgctggaccagtgggtgtttgggactgtaatgtgcaaagtggtgtctggcttttattacattggcttctacagcagcatgtttttcatcaccctcatgagtgtggacaggtacctggctgttgtccatgccgtgtatgccctaaaggtgaggacgatcaggatgggcacaacgctgtgcctggcagtatggctaaccgccattatggctaccatcccaaacctagtgttttaccaagtggcctctgaagatggtgttctacagtgttattcattttacaatcaacagactttgaagtggaagatcttcaccaacttcaaaatgaacattttaggcttgttgatcccattcaccatctttatgttctgctacattaaaatcctgcaccagctgaagaggtgtcaaaaccacaacaagaccaaggatatcaggttggtgctcattgtggtcattgcatctttacttttctgggtcccattcaacgtggttcttttcctcacttccttgcacagtatgcacatcttggatggatgtagcataagccaagcgctgacttatgccacccatgtcacagaagcgatttcctttactcactgctgtgtgaaccctgttatctatgcttttgttggggaggaattcaagaaacacctctcagaaatatttcagaaaagttgcagccaaatcttcaactacctaggaagacaaatgcctagggagagctgtgaaaagtcatcatcctgccagcagcactcctcccgttcctccagcgtagactacattttgtaa。

26、第二方面，本技术提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的ccr8突变体。

27、第三方面，本技术提供一种重组质粒，所述重组质粒含有第二方面所述的核酸分子。

28、在一些实施方式中，所述重组质粒的载体为pcdna3.1。

29、第四方面，本技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的重组质粒。

30、在一些实施方式中，所述宿主细胞包括hek293细胞系或expi293细胞系。

31、第五方面，本技术提供一种根据第一方面所述的ccr8突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组质粒或第四方面所述的宿主细胞在靶向ccr8药物筛选、抗体结合活性检测、抗原制备中的应用。

32、相对于现有技术，本技术具有以下有益效果：

33、本技术的突变组合经过严密的结构学设计，在c63y、l168n、a236d、k306e的基础上，引入了i69a、q277a、i287a三个特定核心突变位点，产生极强的空间协同效应，提升蛋白表达丰度的同时，完美保留了受体n端及第二胞外环（ecl2，extracellular loop 2）的天然复杂构象，第二胞外环是ccr8受体关键构象表位区域，使得本技术所述ccr8突变体能够被临床级针对构象表位的参比抗体精准识别。

34、特别地，实验证明仅含所述三个新突变的突变体虽能提升表达量，但构象明显受损（ratio值仅0.07），而进一步组合c63y、l168n、a236d、k306e突变后，不仅表达量进一步提升，且构象比值恢复至健康水平（ratio 0.14），表明c63y、l168n、a236d、k306e突变与i69a、q277a、i287a突变产生了“1+1>2”的协同效应，该效果对于本领域技术人员而言是预料不到的。

35、在重组蛋白构象鉴定的流式方法学上，本技术特异性建立了基于“阴性对照组本底绝对豁免”和“荧光单色分管平行检测”的评价体系，彻底消除了常规双染造成的空间位阻与荧光补偿误差，实现了对受体构象保留度的严谨相对定量。