一种广谱抗丽沙病毒的多价mRNA疫苗组合物及其制备方法

本发明涉及生物医药与免疫预防，尤其涉及一种广谱抗丽沙病毒的多价mrna疫苗组合物及其制备方法。

背景技术：

1、狂犬病（rabies）是由弹状病毒科丽沙病毒属（lyssavirus）引起的一种严重的急性致死性人兽共患传染病，一旦发病，病死率几乎为100%。目前，广泛使用的人用和兽用狂犬病疫苗绝大多数为基于经典狂犬病病毒（rabies virus，rabv）株培养的传统灭活疫苗。然而，随着全球生态监测的深入，越来越多的非狂犬病丽沙病毒在野生动物中被发现。目前国际病毒分类委员会（ictv）已确认了至少18种丽沙病毒，并依据其遗传和抗原特征划分为不同的遗传谱系（phylogroup）。大量临床与实验室数据表明，现有的基于经典rabv（属于遗传谱系i）的传统灭活疫苗，仅能对同谱系的病毒提供交叉保护；而对遗传距离较远的谱系ii及独立的高变异谱系几乎无交叉中和活性，存在严重的“免疫逃逸”现象。这意味着一旦这些远源突变株发生跨物种感染，现有疫苗防控体系将面临失效风险。此外，传统灭活疫苗的生产严重依赖于复杂的细胞培养与高致病性活病毒的扩增，生物安全风险高且生产周期漫长，难以在新型变异株爆发时实现疫苗抗原的快速更新与应急生产。因此，本领域亟需开发一种安全性高、研发周期短的新型疫苗平台。如何克服现有狂犬病疫苗抗原覆盖面窄的技术缺陷，建立一种能够基于不同丽沙病毒抗原与交叉中和特征，在尽可能少的抗原组分条件下筛选具有更广保护覆盖潜力的候选多价疫苗组合的技术方案，以应对不断涌现的新型丽沙病毒威胁，已成为当前公共卫生与生物医药领域亟待解决的重要技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种广谱抗丽沙病毒的多价mrna疫苗组合物及其制备方法，以解决现有技术中传统狂犬病疫苗抗原覆盖面窄、对新型远源丽沙病毒变异株存在严重免疫逃逸，且传统灭活疫苗生产周期长、无法快速响应新发疫情的问题。基于单价mrna疫苗诱导血清的交叉中和结果，本发明进一步提出一种用于确定广谱候选疫苗组合的设计策略，以在尽可能少的抗原组分条件下获得更大范围的保护覆盖。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种丽沙病毒糖蛋白mrna，所述丽沙病毒糖蛋白mrna的核苷酸序列如seq id no:24~41任一所示。

4、本发明还提供了一种丽沙病毒糖蛋白编码序列，所述丽沙病毒糖蛋白编码序列如seq id no:2~19任一所示。

5、本发明还提供了一种丽沙病毒糖蛋白mrna的制备方法，含有以下步骤：

6、（1）将基因序列1克隆至质粒中，得到重组质粒；

7、（2）将重组质粒线性化，得到线性化dna；

8、（3）以线性化dna为模板进行体外转录，得到丽沙病毒糖蛋白mrna；

9、所述基因序列1为含有seq id no:2所示的丽沙病毒糖蛋白编码序列时，获取方法为：将t7启动子序列、5'非翻译区序列、kozak序列、所述的丽沙病毒糖蛋白编码序列seq idno:2、终止密码子序列、3'非翻译区序列、反向终止密码子序列和多聚腺苷酸尾序列连接；

10、所述基因序列1为含有seq id no:3~19任一所示的丽沙病毒糖蛋白编码序列时，获取方法为：将t7启动子序列、5'非翻译区序列、kozak序列、所述的丽沙病毒糖蛋白编码序列seq id no:3~19任一所示、6×his标签序列、终止密码子序列、3'非翻译区序列、反向终止密码子序列和多聚腺苷酸尾序列连接。

11、作为优选，步骤（1）所述质粒为gs-cmv-100a-bspqi；

12、步骤（2）所述重组质粒线性化的方法为：使用

bspqi限制性内切酶对重组质粒进行单酶切，所述单酶切的温度为45~55℃；

13、所述5'非翻译区序列的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述6×his标签序列的核苷酸序列如seq id no:20所示，所述3'非翻译区序列的核苷酸序列如seq id no:21所示，所述反向终止密码子序列的核苷酸序列如seq id no:22所示，所述多聚腺苷酸尾序列的核苷酸序列如seq id no:23所示。

14、作为优选，步骤（3）所述体外转录的pcr总反应体系为95~105μl：7~9u/μl的t7 rna聚合酶、4~6mm的atp、4~6mm的gtp、4~6mm的ctp、2~3mm的假尿苷三磷酸、3~5mm的cleancapag共转录加帽试剂、（0.5~1.5）×ivt buffer、0.001~0.003 u/μl无机焦磷酸酶、0.5~1.5u/μl rnase抑制剂和50~70 ng/μl线性化dna；

15、所述体外转录的时间为45~75min；

16、所述体外转录后还包括使用dnase i消化线性化dna的步骤，所述消化的温度为35~39℃，所述消化的时间为10~20min；

17、所述丽沙病毒糖蛋白mrna还经过了磁珠纯化法净化，所述磁珠纯化法净化的步骤为：将丽沙病毒糖蛋白mrna与无酶水混合，得到溶液1，在溶液1中加入rna纯化磁珠溶液，静置结合4~6min，弃上清，清洗1~3次，晾干4~6min后，洗脱，磁力分离转移上清，即得；

18、所述丽沙病毒糖蛋白mrna与无酶水体积比为0.8~1.2：1~2；所述rna纯化磁珠溶液为溶液1体积的1.5~2倍，所述清洗的溶液为75~85vt%的乙醇。

19、本发明还提供了一种抗丽沙病毒mrna疫苗，所述抗丽沙病毒mrna疫苗含有所述的丽沙病毒糖蛋白mrna。

20、本发明还提供了所述抗丽沙病毒mrna疫苗的制备方法，包括以下步骤：

21、a、将sm102乙醇溶液、dspc乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液、dmg-peg2000乙醇溶液混合，得到溶液1；

22、b、将所述的丽沙病毒糖蛋白mrna和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合，得到溶液2；

23、c、将溶液1和溶液2混合，得到mrna-lnp混合物溶液；

24、d、将mrna-lnp混合物溶液和tris缓冲液混合猝灭，超滤浓缩，缓冲液置，即得。

25、作为优选，步骤a所述溶液1中sm102、dspc、胆固醇、dmg-peg2000的摩尔比为45~55：8~10：35~40：1~2；

26、步骤b所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的ph为3~5，所述丽沙病毒糖蛋白mrna和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液用量比为300~500μg：0.8~1.2ml；

27、步骤c所述溶液1和溶液2的体积比为0.8~1.2：2~4；

28、步骤d所述mrna-lnp混合物溶液和tris缓冲液的体积比为0.8~1.2：8~10；所述tris缓冲液的浓度为15~25mm。

29、本发明还提供了一种抗丽沙病毒的mrna疫苗组合，含有所述的seq id no:24、seqid no:26和seq id no:37。

30、本发明的有益效果为：

31、（1）本发明首次公开了一种覆盖丽沙病毒属代表株的mrna及其疫苗库构建方法，并基于此提出了一种多价广谱疫苗设计策略。与传统细胞培养的灭活狂犬病疫苗相比，本发明的mrna疫苗生产周期极短，无需接触高致病性活病毒，生物安全性高。更重要的是，本发明通过系统建立活病毒与假病毒交叉中和图谱，确证了现用疫苗对ikov、mokv等远源突变株的严重免疫逃逸缺陷。本发明提供的多价疫苗组合策略，能够填补这一免疫盲区，实现对丽沙病毒属全谱系的广谱免疫保护。

32、（2）本发明的mrna分子引入了cleancap ag共转录加帽技术和pseudo-utp假尿苷修饰，高度模拟了天然真核生物的mrna结构。这一设计不仅有效逃避了宿主细胞tlr等天然免疫受体的识别，显著降低了疫苗的急性炎症反应，还极大提升了外源g蛋白在体内的翻译效率，使其能够完美维持天然的三聚体（trimer）高级空间构象，从而诱导出更具针对性的中和抗体。

33、（3）本发明采用高度优化的sm102-lnp递送系统结合微流控混合工艺，确保了疫苗颗粒的理化性质（平均粒径75-120nm，多分散系数pdi<0.25，包封率>90%），解决了游离rna在体内易降解的难题。动物实验表明，该疫苗在小鼠体内展现出优异的系统安全性（无显著持续性体重下降）；且在常规剂量及两针法免疫下，即可诱导产生远超who保护阈值（0.5iu/ml）的高效价特异性中和抗体。综上所述，本发明的狂犬病病毒及丽沙病毒mrna疫苗是一种制备快速、安全性好、效力高且具广谱保护潜力的下一代新型疫苗候选物。