细胞色素P450酶CYP5150L8突变体及其在灵芝酸合成中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种细胞色素p450酶cyp5150l8突变体及其在催化羊毛甾醇c26位氧化生成灵芝酸hldoa中的应用。

背景技术：

1、灵芝（

ganoderma lucidum）是我国传统药用真菌，其含有的三萜类化合物——灵芝酸具有抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性。然而，灵芝酸结构复杂、在天然宿主中产量极低，难以通过传统提取方式满足产业化需求。通过合成生物学手段构建高效的微生物细胞工厂，实现灵芝酸的异源生物合成，是突破这一资源瓶颈的重要途径。

2、酿酒酵母（

saccharomyces cerevisiae）因其遗传背景清晰、操作工具成熟、具备真核表达系统，已成为萜类化合物异源合成的理想底盘。在灵芝酸生物合成途径中，细胞色素p450单加氧酶cyp5150l8是首个被鉴定的关键酶，能够催化四环三萜骨架羊毛甾醇在c26位发生连续氧化，生成关键中间体灵芝酸hldoa。该酶的功能发挥是后续复杂灵芝酸结构多样化的基础。

3、然而，cyp5150l8在异源宿主中的催化效率普遍偏低，导致灵芝酸hldoa的产量远未达到工业化应用水平。因此，通过蛋白质工程手段对cyp5150l8进行定向改造，获得催化活性显著提升的突变酶，对于构建高效的灵芝酸合成细胞工厂具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是获得能够高效催化羊毛甾醇c26位氧化生成灵芝酸hldoa的cyp5150l8突变体，实现灵芝酸hldoa的高效合成。

2、本发明通过对灵芝（

ganoderma lucidum）来源的细胞色素p450酶cyp5150l8（uniprot a0a2r4sbw0）进行半理性改造，获得高效催化羊毛甾醇氧化的突变体。通过氨基酸共进化分析和位置特异性评分矩阵（pssm）筛选关键突变位点，结合结构模拟与能量计算，获得cyp5150l8突变体。构建可在酵母中表达的重组质粒，并在酿酒酵母中进行异源表达。通过发酵培养，从发酵产物中提取得到灵芝酸hldoa，且产量显著高于野生型酶。

3、一种细胞色素p450酶cyp5150l8突变体，其氨基酸序列如序列表seq id no：1-4所示。

4、一种细胞色素p450酶cyp5150l8突变体的基因，其核苷酸序列如序列表seq idno：5-8所示。

5、在氨基末端或羧基末端连接有标签序列，优选地是poly-arg、poly-his、flag、strep-tag ii、c-myc，更具体是rrrrr、hhhhhh、dykddddk、wshpqfek、eqkliseedl。为了使蛋白便于纯化，可在由seq id no：1-4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

6、表1 标签的序列

7、

8、含有所述cyp5150l8突变体基因的重组表达载体。

9、含有所述重组表达载体的重组宿主细胞。所述宿主细胞为酿酒酵母。

10、一种制备灵芝酸hldoa的方法，以羊毛甾醇为底物通过权利要求1所述的cyp5150l8突变体催化实现。

11、所述制备灵芝酸hldoa的方法，其是通过含有所述cyp5150l8突变体基因的重组菌株发酵制备。所述重组菌株是酿酒酵母。

12、所述cyp5150l8突变体在制备灵芝酸类化合物中的应用。

13、本发明的有益效果：本发明获得的cyp5150l8突变体可以高效催化羊毛甾醇c26位连续氧化生成灵芝酸hldoa，该反应是灵芝酸类化合物生物合成的关键起始步骤。将所述突变体在酿酒酵母底盘细胞中表达，可显著提高灵芝酸hldoa的产量，为灵芝酸类化合物的异源高效合成提供了优良酶元件，具有重要的应用价值。

1.一种细胞色素p450酶cyp5150l8突变体，其特征在于，其氨基酸序列如序列表seq idno：1-4所示。

2. 一种细胞色素p450酶cyp5150l8突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表seq id no：5-8所示。

3.含有权利要求2所述突变体基因的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组宿主细胞。

5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母。

6.一种制备灵芝酸hldoa的方法，其特征在于，以羊毛甾醇为底物，通过权利要求1所述的cyp5150l8突变体催化实现。

7.如权利要求6所述制备灵芝酸hldoa的方法，其特征在于，其是通过含有权利要求2所述突变体基因的重组菌株发酵制备。

8.如权利要求7所述制备灵芝酸hldoa的方法，其特征在于，所述重组菌株为酿酒酵母。

9.权利要求1所述cyp5150l8突变体在制备灵芝酸类化合物中的应用。