一种直接用于从复杂基质中提取和富集痕量微生物的系统和方法与流程

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种直接用于从复杂基质中提取和富集痕量微生物的系统和方法。

背景技术：

1、感染性疾病是临床常见疾病，每年全球有3150万人患有血液感染，500万人患有脑膜炎，而全球1/2女性及1/20男性患有尿路感染，除此之后，胸腹感染也十分常见。病原体诊断是其诊治中的关键环节,而常规病原体检测方法为微生物培养法，然而此方并不是理想的金标准，因为耗时长(1-5天)、结果往往来不及，阳性率低(检出率不到15％)、结果不完整或不够灵敏，并且有可能有误导性且相对劳动密集型的，因此，难以满足临床需求。

2、感染性疾病特别是血液感染，因其样本中病原体含量较低(1-10cfu/ml)，从病人取样到提供样品的感染结果之间通常需要1-5天的诊断时间。因此，全球每年有1940万人经历严重血液感染，平均死亡率达到16-40％。据估计，在全球范围内中每年发生300万例新生儿败血症病例，每年导致120万例儿童死亡，死亡率为11–19％。此外，每年有超过75,000名妇女由于产后败血症而亡。在美国医院里，败血症不仅是最昂贵的疾病治疗，也是主要的死亡原因。美国每年有多达310万例败血症病例，费用为240亿美元，死亡率在20％至50％之间。在欧洲，因为败血症而死亡的概率更高，比美国高约10-15％。最近的研究表明，患有严重血液感染或休克性血液感染的患者，在没有抗生素治疗的前提下，每小时死亡的可能性增加7.6％。在识别到低血压的前6个小时内，若未使用抗生素，存活率也会大大降低。所以，缩短诊断时间可以大大提高病人的成活率。因此，快速的早期诊断方法是提高感染类病人生存率和限制幸存者残疾的最可靠希望，而快速的可以在几个小时内提供诊断相关信息的高灵敏度、小样本需求量的产品是临床的迫切需要。

3、药敏试验是一种用来检测细菌或其他微生物对抗生素或其他药物的耐药性和敏感性的方法，是指导临床合理用药、减少药物滥用及提高治疗效果的重要手段。传统的药敏试验主要包括纸片扩散法、稀释法和自动化药敏试验系统等。为了满足临床快速诊断的需求，药敏试验需要向更快速、更简便的方向发展。通过采用新技术和新方法，可以缩短药敏试验的时间周期，为临床医生提供更加及时的用药指导。但药敏试验结果往往受到培养条件、微生物种类等多种因素的影响，且感染样本往往需要通过培养后才能进行药敏试验，样本增菌分离培养时间较长，无法快速选择合适的抗菌药物和合理的抗菌药物剂量。

4、maldi-tof ms是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，临床微生物实验室将之用于鉴定培养后的大量的细菌和真菌，鉴定结果全程自动判读、自动分析、自动报告、标本自动卸载，且检测成本低，仪器使用耗材只需样品板和质谱专用基质，无须其他任何附加试剂，对工作人员的技术要求不高。由于其鉴定具有高效性和准确性，且实验成本很低，已经成为微生物鉴定的热门方法。

5、病原体培养仍然是检测感染类样本检测的金标准，但是病原培养有很多缺点，首先是诊断时间较长，从病人取样到提供样品的感染结果之间通常需要1～5天的诊断时间，再将纯化后的病原体进行药敏试验，则需要更久。在这段时间内，通常疗法是给病人使用广谱的非靶向性的抗生素进行治疗，这可能会在治疗该疾病方面取得效果，但会导致很多微生物产生多重抗药性。其次，样本中病原体的差异，导致其对培养条件的需求差异很大，经过培养的优势菌很可能并不是样本中的原始状态。再者，获取的感染性样本如果用于药敏试验或者maldi-tof ms检测，样本前处理流程过于复杂，病原菌培养需要投入大量的人力、物力、时间和金钱，成本较高，对操作人员要求也较高，不好推广。最后，经长时间培养出来的菌体很可能是污染菌，导致无法给临床医生提供正确的参考结果。

6、maldi-tof ms质谱仪目前尚不能用于对临床标本和混合培养物的直接检测，分析对象必须是单一、纯的微生物，其对微生物的高准确性及可重复性鉴定是基于对微生物核糖体蛋白(相对分子质量2000～20000)的检测，这是一类在微生物胞内固定表达的高丰度蛋白，因此，理论上不同的培养条件不会导致maldi-tof ms的鉴定结果的明显差异。但是为了达到更理想的鉴定结果，实验室目前需要培养两次，再挑取单克隆菌落进行maldi-tofms鉴定，费时费力。另外，maldi-tof ms鉴定细菌通常需要105～107菌落形成单位(cfu)的菌量。因而如果做直接检测，血流感染或脑膜炎感染初期的样本很可能不能富集到足够检测的菌量或者需要过多的样本。而且如果样本存在两种以上的混合感染，那检测结果通常会失败或存在错误。

7、上述方法均未能很好的实现试验的自动化控制。

技术实现思路

1、为改善上述技术问题，本发明提供一种直接用于从复杂基质中提取和富集痕量微生物的系统，所述系统包含依次连接的硬件连接模块、业务逻辑调度模块、数据处理模块、界面显示模块和数据存储模块；

2、所述界面显示模块还分别与软件配置模块和样品管理模块相连。

3、根据本发明的实施方案，所述界面显示模块用于提供用户图形界面交互。

4、根据本发明的实施方案，所述界面显示模块包括主界面控制模块、硬件参数模块、用户登录模块和工程师参数模块；主界面控制模块、硬件参数模块、用户登录模块和工程师参数模块并列设置。其中，所述用户登录模块用于用户进行系统登录；所述硬件参数模块用于系统的参数设置，所述主界面控制模块用于系统的监控；所述工程师参数模块用于工程师维护系统。

5、根据本发明的实施方案，所述数据处理模块与界面显示模块的主界面控制模块相连。

6、根据本发明的实施方案，所述硬件参数模块还直接与硬件连接模块相连。

7、根据本发明的实施方案，所述硬件连接模块与所述业务逻辑调度模块连接，用于控制工作站的硬件执行提取操作(如样本分离、溶剂注入等)的相关指令；所述硬件连接模块具体包括机械臂模块，混匀模块、离心机模块、样本位模块和试剂位模块等；所述硬件包括机械臂、混匀组件、离心机组件6、样本位组件17和试剂位组件14等，各个模块负责各自硬件的动作指令执行逻辑。具体的，所述机械臂模块控制机械臂；所述混匀模块控制混匀组件；所述离心机模块控制离心机组件6；所述样本位模块控制样本位组件17；所述试剂位模块控制试剂位组件14。

8、根据本发明的实施方案，所述用户登录模块与数据存储模块、软件配置模块、样品管理模块、数据处理模块均为并列关系。

9、根据本发明的实施方案，所述工程师参数模块存储在数据存储模块内，其分别与软件配置模块和样品管理模块为并列关系。

10、根据本发明的实施方案，所述硬件参数模块存储在数据存储模块内；硬件参数模块中的硬件参数通过软件配置模块传达到硬件连接模块进而实现动作的执行；硬件参数模块与样品管理模块属于并列关系。

11、本发明中，主界面控制模块是通过业务逻辑调度模块下发指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中的相关参数，并将所述相关参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块以执行该指令。主界面控制模块与样品管理模块属于并列关系。

12、根据本发明的实施方案，所述工作站包括：

13、其包括主机架1、机械臂、混匀组件、离心机组件6、样本位组件17、工作台组件15和试剂位组件14；

14、所述机械臂位于所述主机架的上部，且所述机械臂通过控制系统控制；

15、所述混匀组件、样本位组件17、工作台组件15和试剂位组件14依次并排放置在所述主机架的中部，且位于所述机械臂的下方；

16、所述离心机组件位于所述主机架的下部。

17、根据本发明的实施方案，所述机械臂包括移液机械臂4和移管和开/关盖机械臂5，所述移液机械臂和移管和开/关盖机械臂并列放置。所述移液机械臂用于向试剂管内加入或取出液体，例如，所述试剂管为样品管或离心管。所述移管和开/关盖机械臂用于移动试剂管，或者用于打开或盖合试剂管的盖子。

18、根据本发明的实施方案，所述混匀组件包括颠倒混匀组件8和加热组件9。

19、优选地，所述混匀组件还进一步包括震荡组件10。

20、优选地，所述颠倒混匀组件8、加热组件9和震荡组件10依次并列放置。

21、根据本发明的实施方案，所述主机架的中部还设有配平台组件11，所述配平台组件11与试剂位组件14并排放置。所述配平台组件11用于离心管进离心机时的配平。

22、所述试剂位组件14用于放置助剂，例如，所述助剂包括裂解液、微生物助沉剂和洗涤液等中的至少一种。

23、根据本发明的实施方案，所述主机架的中部还设有至少一组吸头位组件12，所述吸头位组件12与所述配平台组件11并列放置；所述吸头位组件用于放置耗材枪头。优选地，所述主机架的中部含有至少两组吸头位组件，包括200μl吸头位组件和5ml吸头位组件13。优选地，所述至少两组吸头位组件分别为用于放置耗材200μl枪头和耗材5ml枪头。

24、根据本发明的实施方案，所述工作站还包括抛废液和废料位组件16，所述抛废液和废料位组件16位于所述主机架1的中部。优选地，所述抛废液和废料位组件16与所述工作台组件15并排放置。

25、根据本发明的实施方案，所述工作站还包括废液和废料收集桶7，位于主机架的下部，所述废液和废料收集桶7与所述离心机组件6并排放置，用于收集废液或废料。

26、根据本发明的实施方案，所述主机架的顶部还设有空气过滤组件2，所述空气过滤组件用于过滤空气。

27、根据本发明的实施方案，所述主机架的外部还设有操作屏幕3，所述操作屏幕3用于控制机械臂，用于后续的实验操作。优选地，所述操作屏幕3设置在主机架1的外部的侧面，例如在右侧面或左侧面。

28、根据本发明的实施方案，所述主机架的中部还设有扫码器组件18，所述扫码器组件与所述混匀组件并排放置。优选地，所述扫码器组件与所述颠倒混匀组件8并排放置。

29、根据本发明的实施方案，采用所述工作站进行痕量微生物的提取和富集方法包括：

30、(1)采用机械臂将装有血样的样品管移动至混匀组件中混匀样本，混匀后，采用机械臂分别将混匀后的样品管和离心管移动至工作台组件5中；

31、(2)采用机械臂将样品管中的样品转移至离心管中，得到含有血样的离心管；

32、(3)采用机械臂从试剂位组件中移取助剂加入到含有血样的离心管中，并继续采用机械臂将离心管移动至混匀组件中，使样品混合均匀；

33、(4)采用机械臂将离心管移动至离心机组件中，进行离心操作；

34、(5)离心结束后，采用机械臂将离心管移动至工作台组件中，去除上清液，完成痕量微生物的提取和富集。

35、根据本发明的实施方案，步骤(1)中，所述机械臂包括移液机械臂和移管和开/关盖机械臂；所述移液机械臂用于向离心管内加入或取出液体。所述移管和开/关盖机械臂用于移动离心管，或者用于开或盖离心管的盖子。

36、根据本发明的实施方案，步骤(1)中，所述混匀组件包括颠倒混匀组件8和加热组件9。

37、优选地，所述混匀组件还进一步包括震荡组件10。

38、根据本发明的实施方案，步骤(1)还包括收集废枪头的过程；当机械臂从试剂位组件中通过枪头移取血样加入到离心管中后，将废枪头置入废液和废料收集桶中；所述废液和废料收集桶设置于抛废液和废料位组件中。

39、根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述机械臂通过耗材枪头从试剂位组件中移取助剂。优选地，所述枪头置于吸头位组件12中。

40、根据本发明的实施方案，步骤(3)还包括收集废枪头的过程；当机械臂从试剂位组件中通过枪头移取助剂加入到含有血样的离心管中后，将废枪头置入废液和废料收集桶中；所述废液和废料收集桶设置于抛废液和废料位组件中。

41、根据本发明的实施方案，步骤(1)和步骤(2)具体为：

42、采用机械臂将装有血样的样品管移动至混匀组件中混匀样本，混匀后，采用机械臂将离心管和装有血样的样品管移动至工作台组件中，采用机械臂将离心管和样品管的盖子打开，再采用机械臂从吸头位组件12取耗材枪头，通过枪头将血样从样品管移动至离心管中，得到含有血样的离心管。

43、根据本发明的实施方案，步骤(1)中，还可以先对离心管和样品管进行扫描操作；所述扫描操作通过扫码器组件18实现。

44、根据本发明的实施方案，步骤(1)中，在进行操作前，还可以先对工作站进行抽气、换气操作，以实现无菌操作；所述行抽气、换气操作通过空气过滤组件2实现。

45、根据本发明的实施方案，步骤(4)中，还可以对含有样品的离心管进行重量配平，所述配平操作通过配平台组件11实现。

46、根据本发明的实施方案，步骤(5)中，所述机械臂通过耗材枪头从离心管中去除上清液。

47、根据本发明的实施方案，所述机械臂通过操作屏幕控制，所述操作屏幕外接控制系统。

48、根据本发明的实施方案，所述业务逻辑调度模块用于提供与硬件控制相关的执行逻辑调度，其包括程序执行单元、时间控制单元、状态管理单元、异常处理单元、运动控制单元等，上述各单元属于本领域已知的装置。所述业务逻辑调度模块中各单元互相配合，为整个富集流程正确高效地运行提供有力的支撑。

49、根据本发明的实施方案，所述程序执行单元用于按预设流程执行微生物富集操作的全自动化程序。

50、例如，所述程序执行单元可以解析用户输入的实验参数(如离心转速、混匀时间、加热温度等)，生成可执行的指令序列。

51、例如，所述程序执行单元用于控制硬件连接模块，按顺序执行样本转移、试剂添加、离心分离、混匀震荡等操作。

52、例如，所述程序执行单元可以调整实验参数(例如样本的体积、震荡时间)，通过调用预存参数模板实现灵活适配。

53、根据本发明的实施方案，所述时间控制单元精确管理各步骤的时间节点与同步性，确保实验流程的高效性与准确性。

54、优选地，所述时间控制单元可以设定并监控每个操作步骤的持续时间(如离心时间、混匀时间等)。

55、优选地，所述时间控制单元协调多硬件连接模块的并行操作(例如在离心机组件运行时同步预热加热组件)。

56、优选地，所述时间控制单元提供倒计时功能，超时自动触发警报或转入异常处理流程。

57、根据本发明的实施方案，所述状态管理单元实时监控系统硬件与软件状态，确保运行环境稳定。

58、优选地，所述状态管理单元用于检测硬件连接模块的实时状态(如离心机组件是否就绪、移液机械臂4和移管和开/关盖机械臂5位置是否正常、试剂余量是否充足)。

59、优选地，所述状态管理单元用于记录实验进程的当前阶段(如“加液中”“震荡中”)。

60、优选地，所述状态管理单元通过传感器数据反馈(如温度、到位)动态调整操作参数，避免流程中断。

61、根据本发明的实施方案，所述异常处理单元自动识别并响应工作站运行中的故障或偏差，保障系统安全性与可靠性。

62、优选地，所述异常处理单元检测常见异常(如移管+开/关盖机械臂、移液机械臂组件卡顿、离心机组件异常等)，触发预设的应急措施(如暂停流程、报警提示)。

63、优选地，所述异常处理单元支持错误日志记录与故障定位，便于工程师远程诊断或现场维护。

64、优选地，所述异常处理单元为用于提供异常提示界面(如弹窗报警、声音提醒)，并推荐解决方案。

65、根据本发明的实施方案，所述运动控制单元用于精准控制硬件的路径规划与动作执行。

66、优选地，所述运动控制单元根据实验流程规划移液机械臂4或移管和开/关盖机械臂5的移动路径(如从工作台抓取试管，转移至离心机组件等)。

67、优选地，所述运动控制单元校准移液机械臂的吸液与排液精度(如确保200μl吸头准确吸取样本)。

68、优选地，所述运动控制单元支持多轴联动控制(如同时操作移液机械臂和移管和开/关盖机械臂5)，提升操作效率。

69、根据本发明的实施方案，所述数据处理模块与数据存储模块直接交互，包括读写枪头参数、机械臂参数、离心机参数、步骤参数、权限管理参数、工程师维护参数等。

70、根据本发明的实施方案，所述数据存储模块用于存储从数据处理模块接受的数据，其采用安卓本地文件json格式存储数据，提高程序的读写效率。

71、根据本发明的实施方案，所述软件配置模块用于提供硬件连接模块与数据存储模块(从数据存储模块中获得的硬件参数数据)之间的数据交互支持，解析用提供从数据存储模块获取的硬件参数数据，驱动硬件连接模块能够依据所述参数数据执行精确的硬件操作，例如通过以太网通信、串口通信等有效的与下位机系统进行交互，实现对仪器的有效控制，确保提取过程中参数的一致性和运行可靠性。

72、例如，所述界面显示模块直接通过以太网实现tcp/ip通信；

73、所述工作站中的机械臂、离心机等通过串口通信。

74、根据本发明的实施方案，所述系统还包括样品管理模块。所述样品管理模块与主界面控制模块连接。

75、根据本发明的实施方案，所述样品管理模块用于将试剂/样本放置在工作站指定位置。

76、所述系统的工作原理如下：

77、(1)首先先对工作站进行开机，然后通过界面显示模块上的用户登录模块进行系统登录，然后先对工程师参数模块中的工程师参数进行设置，再对硬件参数模块中的系统参数(例如读写枪头参数、机械臂参数、离心机参数、步骤参数(包括加热参数、振荡参数、摇匀参数)、权限管理参数、工程师维护参数等)进行设置(此功能是根据要做的试验情况进行设置的)，上述参数会直接存储在数据存储模块中以供后面系统调取使用；

78、(2)然后将样本放置在工作站指定样本位置，然后在界面显示模块上对样品管理模块进行设置，然后将对应的试剂/耗材放置在工作台面指定位置；

79、(3)通过主界面控制模块开始工作站试验流程运行系统先是在主界面控制模块操作，通过业务逻辑调度模块下发样本扫码指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中的样本扫码相关的参数，然后样本扫码参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行样本扫码；

80、(4)然后业务逻辑调度模块下发混匀指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中混匀参数，然后混匀参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行样本混匀动作；

81、(5)接着业务逻辑调度模块下发将混匀后的样本及离心管耗材放置到工作台指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中机械臂参数，然后机械臂参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行转运动作；

82、(6)然后业务逻辑调度模块下发样本分装指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中相关分装参数，然后分装参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行分装动作；

83、(7)然后业务逻辑调度模块下发试剂加注指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中相关加注试剂相关的参数，然后试剂加注参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行试剂加注动作；

84、(8)然后业务逻辑调度模块下发震荡指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中震荡相关的参数，然后震荡参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行转运震荡动作；

85、(9)然后业务逻辑调度模块下发加热指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中加热相关的参数，然后加热参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行转运加热动作；

86、(10)然后加热完的样本需进入离心机组件进行离心，业务逻辑调度模块下发离心指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中的离心相关的参数，然后离心参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行转运离心动作；

87、(11)接着离心完的样本需取出并完成取上清，业务逻辑调度模块下发取上清指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中的取上清相关的参数，然后取上清参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行转运取上清动作；

88、(12)最后试验完毕，将样本放回工作台样本位置，业务逻辑调度模块下发样本放回指令，指令通过数据处理模块读取数据存储模块中的样本放回相关的参数，然后样本放回清参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块执行样本放回动作。

89、本发明还提供一种采用上述系统直接从复杂基质中提取和富集痕量微生物的方法，所述方法包括：

90、(s1)通过界面显示模块进行系统登录、系统参数设置，并将所述系统参数存储在数据存储模块中；

91、(s2)通过在界面显示模块上对样品管理模块进行设置，以使试剂/耗材放置在工作站指定位置；

92、(s3)在主界面控制模块上操作，通过业务逻辑调度模块下对工作站下发相应的指令，所述指令通过数据处理模块读取数据存储模块中的相关参数，并将所述相关参数通过软件配置模块传达给硬件连接模块以执行该指令；

93、(s4)相关指令结束后，完成微生物的提取和富集。

94、根据本发明的实施方案，步骤(s3)中，所述指令包括样本扫码指令、混匀指令、转运指令、样本分装指令、试剂加注指令、加热指令、离心指令、取上清指令等中的至少一种。

95、根据本发明的实施方案，步骤(s3)中，所述相关参数包括样本扫码相关的参数、混匀参数、机械臂参数、分装参数、试剂加注参数、震荡参数、加热参数、离心参数、取上清参数等中的至少一种。

96、本发明的有益效果：

97、1.本发明富集系统可以使用常规耗材及预分装试剂板或条搭配自动化处理工作台进行分离处理。无需手工操作、无需复杂的人员培训和锻炼，省时省力省人工。

98、2.本发明系统可以实现极低丰度的微生物提取、富集及设备控制功能，用户可以进行极低丰度的微生物富集，以获取高通量样品，通过人工智能技术方式实现高通量样品处理和数据分析。

99、3.本发明的工作站用于从复杂基质中提取和富集痕量微生物，其工作流程包含样本识别、开合盖、拿取耗材、加样、混匀(包括振荡、加热等)、离心、吸液弃液等全流程，实现全自动分离处理过程。其中开合盖机构对比其他同类产品结构更紧凑，故障率更低，运行更稳定；移液机械臂采用稳定性更为强大的活塞杆式吸液/排液模式，精度更高，稳定性更强；离心机组件兼容高速、定位和制冷于一身，在实现高速离心的同时，通过其制冷功能迅速降低运行过程中升高的温度，相比于同类产品转速更高、定位更准、温控更精准。本技术的工作站还设有空气过滤系统，可使仪器整个运行过程中保持试验环境的无菌状态，使得试验更为精准，有效的避免污染产生。

100、4.本发明工作站能够富集到极低丰度的微生物，显著提高了检测的准确性和可靠性，结合人工智能技术，实现了高通量样品处理和数据分析，适用于多个领域的痕量微生物检测，具有广泛的应用前景。

101、5.本发明的痕量微生物的提取和富集方法能有效去除血液、脑脊液、尿液、胸腹水等未培养或已培养的临床样本中的大部分人体细胞、蛋白质、糖类、盐等杂质，得到相对纯净的活的病原体。

102、6.本发明方法中，未培养样本分离的病原体产物经简单培养(仅一步液体培养)、收菌处理后可进行药敏试验或者maldi-tof ms检测，而已培养的如血液、脑脊液、胸腹水等样本产物则简单浓缩后可直接用于药敏试验或者maldi-tof ms检测。本发明方法相对于临床感染样本的病原体诊断鉴定缩短了培养时间，能够更快的获得药敏结果和质谱微生物鉴定结果，为临床医生提供更及时的诊疗参考。

103、7.本发明的工作站使用常规耗材及预分装试剂对血样中微生物进行分离处理。无需手工操作、无需复杂的人员培训和锻炼，省时省力省人工。