检测DLBCL结构变异的探针、方法、试剂盒及其应用与流程

本发明属于分子生物及肿瘤病理诊断，具体涉及一种检测dlbcl结构变异的探针、方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、弥漫大b细胞淋巴瘤（diffuse large b-cell lymphoma，dlbcl）是成人非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型，占比约30%-40%，具有高度异质性的生物学特征和临床预后差异。基因融合、重排、增强子劫持等结构变异在dlbcl的发生、发展中发挥关键作用，其精准检测对于揭示肿瘤发病机制、指导临床治疗及预后评估具有重要意义。

2、目前，dlbcl结构变异检测主要依赖rna-seq、荧光原位杂交（fish）技术。rna-seq可有效检测形成融合转录本的结构变异，但无法检出基因间区的结构变异（如增强子劫持），此类变异不产生融合rna，而是通过调控癌基因表达促进肿瘤发生。fish技术可有效检测dlbcl具有临床意义的重现性基因重排，如myc、bcl2和/或bcl6重排。cn102747156b专利利用fish技术对dlbcl患者的原发部位（如淋巴结）石蜡组织切片和骨髓涂片进行检测，发现bcl2基因与igh基因重排可作为dlbcl骨髓浸润与否的分子标志以及治疗效果评价的标志。但fish技术依赖特异性探针设计，仅能检测已知探针覆盖区域的结构变异，对于探针未覆盖的基因间区变异无能为力，且存在检测范围局限、操作繁琐等问题。此外，临床大量保存的福尔马林固定石蜡包埋（ffpe）样本常面临降解、抗原丢失等问题，进一步降低了现有检测技术的敏感性和特异性。

3、hi-c（high-throughput chromosome conformation capture）技术可捕获全基因组范围内的染色质互作信息，为解析染色质三维结构及结构变异提供了有效手段。然而，传统hi-c技术存在测序成本高、数据利用率低、对降解样本适配性差等问题，限制了其在临床结构变异检测中的规模化应用。靶向hi-c技术通过设计特异性探针捕获目标基因区域的染色质互作片段，有效降低成本、提升针对性，但现有靶向hi-c技术应用于dlbcl结构变异检测时，仍面临ffpe样本处理效果差、连接效率低、生物素去除不彻底、靶向捕获特异性不足等技术瓶颈。尤其在探针设计上，常规探针多聚焦单一区域且无明确酶切位点关联设计，导致捕获效率（多低于30%）和分辨率（多限于100kb）不足，同时未针对dlbcl特征基因的结构变异检测进行专项优化，无法充分发挥其在基因间区变异检测中的独特优势。此外，现有dlbcl分子检测相关试剂盒多针对单一标志物或常规测序技术，缺乏适配靶向hi-c技术的专用试剂盒，无法为临床样本的标准化结构变异检测提供支撑。

4、因此，开发一种适配临床ffpe样本、可全面检测dlbcl结构变异（包括基因间区增强子劫持）且与传统检测技术高度一致的靶向hi-c检测方法及专用试剂盒，具有重要的临床应用价值和产业化前景。

技术实现思路

1、为克服现有技术存在的ffpe样本处理效果差、连接效率低、生物素去除不彻底、靶向捕获特异性不足等缺陷，本发明提出了一种基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的探针、方法、试剂盒及其应用。本发明较常规rna-seq或fish检测，具有更优的靶向区域捕获效率和检测分辨率，且样本适配性强、成本可控。

2、本发明的目的之一在于提供一种基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的探针。利用该定制化捕获探针进行检测，可有效提升靶向区域捕获效率和检测分辨率，为弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的有效检测提供了支持。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的探针，所述探针包括seq idno.1~seq id no.100所示的核苷酸序列。

5、优选地，所述探针覆盖myc、bcl2、bcl6核心基因及bcl10、cd274辅助基因的主体、启动子及增强子区域，采用叠瓦式设计，相邻探针重叠区域30-60bp。

6、优选地，所述探针精准设计于每个dpnii酶切位点两侧300bp范围内，确保酶切后片段可被高效捕获。

7、优选地，所述探针的gc含量40%-60%、序列特异性≥98%。

8、优选地，所述探针5'端采用生物素修饰。

9、优选地，所述结构变异包括基因融合、重排、扩增和/或增强子劫持。

10、优选地，所述结构变异包括bcl2-igh融合、bcl6-igh融合、bcl10-igh融合、cd274-zcchc7融合、igk-myc融合、myc-igl融合、bcl6重排、myc-bcl2共重排、bcl10重排、cd274扩增+bcl2融合、myc重排、bcl6-igk融合、bcl2重排+bcl10扩增和/或myc-igh融合。

11、本发明的目的之二在于提供一种基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的试剂盒。

12、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

13、基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的试剂盒，所述试剂盒含有前述探针。

14、优选地，所述试剂盒还包含：

15、特异性衔接子，包括seq id no.176所示的衔接子-序列1和seq id no.177所示的衔接子-序列2；

16、用于ffpe脱蜡及解交联处理的试剂，包括脱蜡液、去污剂和蛋白酶，所述去污剂包括sds、sdc、triton x-100和np40；

17、用于限制性酶切处理的试剂，包括dpnii或mboi；

18、用于末端生物素化标记处理的试剂，包括klenow dna聚合酶；

19、用于连接处理的试剂，包括t4 dna连接酶；

20、用于染色质脱交联处理的试剂，包括磁珠、蛋白酶k和纯化磁珠；

21、用于末端生物素处理的试剂，包括t4 dna聚合酶、核酸外切酶i和核酸外切酶iii。

22、优选地，所述去污剂包括如下终浓度的组分：0.1%-0.7% sds、0.5%-2% sdc、1%-5%triton x-100和0.5%-2% np40。

23、优选地，所述去污剂包括如下终浓度的组分：0.3% sds、1% sdc、3% triton x-100、1% np40。

24、优选地，所述用于ffpe脱蜡及解交联处理的试剂还包括缓冲液；更为优选的，所述缓冲液包含50~100 mm bis-tris-hcl、100~150 mm nacl、10~15 mm mgcl2和0.1~0.15 mmdtt。

25、优选地，所述用于ffpe脱蜡及解交联处理的试剂包含浓度为10-30mg/ml的蛋白酶。更为优选地，蛋白酶浓度为20mg/ml，蛋白酶为蛋白酶k，但不限于同等功能蛋白酶类。

26、优选地，所述用于限制性酶切处理的试剂包括10u/µl dpnii或mboi 12-18µl。

27、优选地，所述用于末端生物素化标记处理的试剂还包括生物素化缓冲液、dctp、dgtp、dttp、biotin-14-datp、和去离子水。

28、优选地，所述用于末端生物素化标记处理的试剂包括8-12×生物素化缓冲液3-4µl、8-12mm dctp 0.5-1µl、8-12mm dgtp 0.5-1µl、8-12mm dttp 0.5-1µl、8-12mm biotin-14-datp 0.5-1µl、4-6u/µl klenow dna聚合酶4-6µl和20-26µl 去离子水；更优选为包括10×生物素化缓冲液3-4µl、10mm dctp 0.5-1µl、10mm dgtp 0.5-1µl、10mm dttp 0.5-1µl、10mm biotin-14-datp 0.5-1µl、5u/µl klenow dna聚合酶4-6µl和20-26µl 去离子水。

29、优选地，所述用于连接处理的试剂还包括triton x-100、bsa和去离子水。

30、优选地，所述用于连接处理的试剂包括8-12×t4 dna连接酶缓冲液50-70µl、8-12% triton x-100 50-70µl、8-12mg/ml bsa 4-8µl、500-700u/µl t4 dna连接酶6-10µl和180-210µl 去离子水。

31、优选地，所述用于连接处理的试剂包括10×t4 dna连接酶缓冲液50-70µl、10%triton x-100 50-70µl、10mg/ml bsa 4-8µl、600u/µl t4 dna连接酶6-10µl和180-210µl去离子水。

32、优选地，所述用于末端生物素处理的试剂还包括hi-c dna、生物素化缓冲液、datp、dgtp和去离子水。

33、优选地，所述用于末端生物素处理的试剂包括hi-c dna 5-15µg、8-12×生物素化缓冲液11-15µl、0.5-2mm datp 2.5-4µl、0.5-2mm dgtp 2.5-4µl、2000-4000u/ml t4 dna聚合酶11-15µl、核酸外切酶i 5-10u、核酸外切酶iii 10-20u和去离子水。

34、优选地，所述用于末端生物素处理的试剂包括hi-c dna 5-15µg、10×生物素化缓冲液11-15µl、1mm datp 2.5-4µl、1mm dgtp 2.5-4µl、3000u/ml t4 dna聚合酶11-15µl、核酸外切酶i 5-10u、核酸外切酶iii 10-20u和去离子水。

35、优选地，所述试剂盒还包含用于去生物素后纯化的试剂，所述用于去生物素后纯化的试剂包括磁珠。

36、本发明提供的试剂盒主要用于ffpe样本脱蜡、解交联、酶切、末端生物素化标记、连接、染色质脱交联、末端处理、靶向捕获及去生物素后纯化，各试剂协同实现脱蜡解交联高效化、连接效率提升、生物素彻底去除及靶向捕获高特异性。

37、本发明的目的之三在于提供一种基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的方法。

38、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

39、基于靶向hi-c检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的方法，采用前述探针和/或前述试剂盒进行检测；

40、所述方法不以疾病的诊断和/或治疗为目的，具体包括如下步骤：

41、s1：向待测样本加入脱蜡液进行脱蜡处理，重悬后加入前述去污剂和蛋白酶进行解交联处理；

42、s2：采用dpnii或mboi酶对s1处理后的样本进行酶切处理；

43、s3：对s2酶切后的样本进行末端生物素化标记；

44、s4：采用t4 dna连接酶并加入特异性衔接子对s3标记后的样本进行连接处理；

45、s5：s4连接后的样本经磁珠洗涤、蛋白酶k消化、纯化磁珠纯化及洗脱，获得纯净染色质dna；

46、s6：使用t4 dna聚合酶、核酸外切酶i和核酸外切酶iii对s5脱交联后的样本进行末端处理，去除未连接末端的生物素；

47、s7：采用前述探针对s6处理后的样本进行靶向捕获；

48、s8：对s7捕获的样本进行高通量测序；

49、s9：对测序数据进行分析，提取结构变异特征。

50、优选地，s4中，连接温度为16-20℃、连接酶浓度为8-10u/µl。

51、优选地，s4中，连接温度为16℃、连接酶浓度为8u/µl。

52、本发明通过优化连接条件并采用特异性衔接子方案，使降解样本的%_intra_ge_15kb_pairs较传统方案提升80.00%，%_unique_valid_pairs提升25.00%。

53、优选地，所述待测样本包括福尔马林固定石蜡包埋样本。本发明方法可有效检测保存超5年的降解样本。

54、优选地，s1中，脱蜡处理反应条件为：50-60℃加热3-10min，2000-3000g离心3-10min；解交联处理条件为：70-78℃孵育40-60min。

55、优选地，s1中，脱蜡处理反应条件为：56℃加热5min，2500g离心5min。

56、优选地，s1中，解交联处理条件为74℃孵育50min。

57、优选地，s1中，脱蜡及解交联处理前，将待测ffpe肿瘤组织样本切成8-12µm蜡卷，更优选为10µm。

58、s1中，本发明采用多种去污剂协同蛋白酶作用，可使%_intra_ge_15kb_pairs较传统单一去污剂方案提升46.00%，%_unique_valid_pairs提升23.01%。

59、优选地，s2中，酶切处理条件包括：35-40℃ 800-1000rpm振荡孵育14-18h，60-70℃ 15-25min灭活酶活性。

60、优选地，s2中，酶切处理条件包括：37℃ 900rpm振荡孵育16h，65℃ 20min灭活酶活性。

61、优选地，s3中，生物素化体系包括8-12×生物素化缓冲液3-4µl、8-12mm dctp0.5-1µl、8-12mm dgtp 0.5-1µl、8-12mm dttp 0.5-1µl、8-12mm biotin-14-datp 0.5-1µl、4-6u/µl klenow dna聚合酶4-6µl和20-26µl 去离子水，总体积32-38µl；反应条件为20-25℃振荡孵育3-5h。

62、优选地，s3中，生物素化体系包括10×生物素化缓冲液3-4µl、10mm dctp 0.5-1µl、10mm dgtp 0.5-1µl、10mm dttp 0.5-1µl、10mm biotin-14-datp 0.5-1µl、5u/µlklenow dna聚合酶4-6µl和20-26µl 去离子水，总体积32-38µl。

63、优选地，s3中，反应条件为23℃振荡孵育4h。

64、优选地，s4中，连接体系包括：8-12×t4 dna连接酶缓冲液50-70µl、8-12% tritonx-100 50-70µl、8-12mg/ml bsa 4-8µl、补水至总体积600µl；反应条件为16-20℃振荡孵育3-5h。

65、优选地，s4中，连接体系包括：10×t4 dna连接酶缓冲液60µl、10% triton x-10060µl、10mg/ml bsa 6µl、补水至总体积600µl。

66、优选地，s4中，900rpm振荡孵育4h。

67、优选地，所述特异性衔接子以5-10µm浓度加入连接反应，更优选为8µm。

68、优选地，s5具体包括：将连接后样本放置到磁力架上静置2min，吸弃上清；加入1ml80%乙醇洗涤2次，短暂离心去除残留乙醇并室温干燥；加入140-160µl水重悬磁珠，依次加入15-25µl缓冲液、8-12µl 10%sds、15-25µl 20mg/ml蛋白酶k，55℃ 25-35min，68℃ 80-100min，25℃ 8-12min；加入140-160µl纯化磁珠，室温孵育5min后放到磁力架上，去上清，用80%乙醇洗涤2次，干燥后加入80-100µl水重悬磁珠，室温孵育5min，转移上清至新管，qubit定量，获得纯净的染色质dna。

69、优选地，s6中，生物素去除反应体系包括hi-c dna 5-15µg、8-12×生物素化缓冲液11-15µl、0.5-2mm datp 2.5-4µl、0.5-2mm dgtp 2.5-4µl、2000-4000u/ml t4 dna聚合酶11-15µl、核酸外切酶i 5-10u、核酸外切酶iii 10-20u和去离子水，总体积120-140µl；反应条件为15-25℃孵育3-5h后70-80℃灭活。

70、优选地，s6中，生物素去除反应体系包括hi-c dna 10µg、10×生物素化缓冲液13µl、1mm datp 3.25µl、1mm dgtp 3.25µl、3000u/ml t4 dna聚合酶13µl、核酸外切酶i 8u、核酸外切酶iii 15u，去离子水补水至130µl。

71、本发明采用复合酶体系较传统单一酶法，可使%_intra_ge_15kb_pairs提升9.0%，%_duplicated_pairs降低50.00%。

72、优选地，s6中，反应条件为20℃孵育4h，75℃ 20min灭活，4℃ hold。

73、优选地，s6反应结束后进行去生物素后纯化处理，包括通过磁珠孵育、洗涤及洗脱，获得高纯度去生物素样本。

74、优选地，所述去生物素后纯化处理具体包括：纯化磁珠提前30min取出平衡至室温；取220-240µl磁珠至130µl连接产物中，振荡混匀，室温孵育5min；放到磁力架上，待溶液澄清后移除上清；加入500µl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠2次，每次室温孵育30s；瞬离后吸弃残液，开盖干燥2min；加入35-45µl洗脱液，振荡混匀，室温放置5min；放到磁力架上，吸取上清至新管，qubit定量、qsep100质检。

75、优选地，s7中，本发明采用定制化捕获探针，靶向区域捕获效率从传统30%提升至60%，检测分辨率从传统100kb提升至5kb。

76、优选地，s8包括：采用华大平台进行双端150bp高通量测序，测序深度≥0.5g。

77、优选地，s9包括：经数据质量控制、采用bwa软件比对至人类参考基因组hg38及去重后，采用juicer软件构建5kb分辨率的染色质互作矩阵；提取结构变异相关特征参数并经ice归一化。

78、优选地，所述数据质量控制包括过滤低质量reads、接头污染reads及重复reads，质量控制标准为q20≥90%、q30≥85%、接头污染率<1%、重复序列占比<10%。

79、优选地，比对效率≥80%。

80、优选地，所述提取结构变异相关特征参数并经ice归一化具体包括：基于染色质互作矩阵，定制化python脚本，提取myc、bcl2、bcl6、bcl10、cd274基因相关的结构变异特征，包括基因融合、重排及基因间区增强子劫持相关的染色质互作异常信号，所有参数经ice归一化消除样本偏差。

81、优选地，可将hi-c检测的结构变异结果与rna-seq/fish检测结果进行一致性分析，评估检测准确性；针对rna-seq阴性但hi-c检测提示增强子劫持的样本，通过设计特异性捕获探针进行验证。

82、本发明的目的之四在于提供一种前述探针和/或前述试剂盒在制备用于检测弥漫大b细胞淋巴瘤结构变异的检测产品中的应用。

83、优选地，所述检测产品用于检测ffpe肿瘤组织样本。

84、本发明的有益效果在于：

85、1、脱蜡及解交联效果显著提升。传统ffpe样本脱蜡及解交联效果不佳，单一去污剂作用有限，解交联不彻底，导致后续实验样本质量下降，影响结构变异检测准确性。本发明创新采用sds结合sdc、triton x-100、np40等多种去污剂联合使用，并协同蛋白酶等酶类作用，有效解决了传统单一去污剂解交联不彻底的问题，显著提升染色质完整性。实验验证显示，%_intra_ge_15kb_pairs较传统方法提升46.00%；%_unique_valid_pairs提升23.01%，为后续实验提供高质量样本基础，直接支撑后续酶切、标记及连接步骤的有效性。

86、2、连接效率大幅优化且适配降解样本。传统连接方法效率低，且缺乏适配降解样本的有效策略，难以形成有效的染色质互作片段，影响文库构建质量。本发明通过精准调整连接温度（16-20℃）和连接酶浓度（500-700u/µl），改善了传统连接步骤效率低的缺陷；针对降解样本设计15-25bp特异性衔接子，进一步提升连接效果。实验数据显示，优化后常规样本%_intra_ge_15kb_pairs较传统方法提升20.11%，降解样本%_intra_ge_15kb_pairs提升80.00%，%_unique_valid_pairs提升25.00%，同时%_inter_pairs降低13.30%，为文库构建提供了更多有效素材，且无需额外预处理即可处理保存超5年的降解样本，拓展了临床样本适用范围。

87、3、生物素去除更彻底。传统方法末端处理（从未连接末端去除生物素）步骤仅采用t4 dna聚合酶，生物素去除不彻底，残留生物素会干扰后续测序及数据分析，降低有效数据比例。本发明创新采用t4 dna聚合酶联合核酸外切酶i和核酸外切酶iii的组合方式，相比传统单一酶法，生物素去除率显著提高。数据验证显示，%_intra_ge_15kb_pairs提升9.09%，%_unique_valid_pairs提升3.00%，大幅减少了残留生物素对测序及数据分析的干扰，提升有效数据比例，为精准提取结构变异特征奠定基础。

88、4、靶向捕获效率与分辨率双重突破。现有靶向捕获探针设计缺乏针对性，覆盖区域有限，且未结合dpnii酶切位点进行精准设计，导致捕获效率（≤30%）和分辨率（≥100kb）不足，无法满足结构变异精准检测需求。本发明定制化靶向捕获探针通过“多区域覆盖（基因主体+启动子+增强子）、酶切位点关联（dpnii位点两侧300bp）、叠瓦式布局（重叠30-60bp）”的创新设计，实现捕获效率从传统30%提升至60%，分辨率从100kb提升至5kb，显著优于现有非特异性探针。高捕获效率确保有效数据充足，高分辨率可精准识别微小结构变异，直接提升结构变异检测的精准度和灵敏度。

89、5、检测结果准确且全面。现有rna-seq/fish检测技术无法全面检测dlbcl结构变异，rna-seq难以检出基因间区的增强子劫持类变异，fish受探针覆盖范围限制，存在检测盲区。本发明一致性验证实验结果显示，10例样本与rna-seq/fish检测结果一致性达100%，可补充检测基因间区增强子劫持类变异，弥补传统技术检测盲区。

90、6、标准化程度高，满足临床需求。本发明经重复性验证cv值低于10%，最低检测限为200ng hi-c dna，检测流程标准化、结果稳定可靠。

91、7、临床应用价值高且成本可控。ffpe样本保存时间久易出现严重降解，传统连接方式难以适配，连接效率极低，有效数据利用率低，导致检测成本居高不下。本发明方法样本适配性强，可直接应用于临床常规ffpe样本，尤其能高效处理保存时间超过5年的降解样本，无需特殊样本制备；检测结果全面、精准，不仅能覆盖传统技术可检测的结构变异，还能补充检测基因间区增强子劫持等特殊变异，为dlbcl发病机制研究、临床治疗方案制定提供更全面的分子依据；同时通过优化连接策略、提升有效数据利用率，间接降低检测成本，具备良好的规模化推广前景。

92、8、试剂盒标准化程度高。专用试剂盒包含定制化靶向捕获探针、特异性衔接子及配套专用优化试剂，各试剂浓度与方法学步骤精准匹配，可协同保障实验流程的标准化与稳定性，避免因试剂适配性问题导致的检测偏差，为临床规模化应用提供可靠支撑。