靶向金黄色葡萄球菌蛋白A适配体及其筛选方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及靶向金黄色葡萄球菌蛋白a适配体及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、金黄色葡萄球菌（

staphylococcus aureus, s. aureus）在食品牛奶中的普遍污染及具有在物体表面形成强耐药性生物被膜的能力，使其引起的食物中毒现象是世界性的卫生难题。因此，建立便携、快速、灵敏的检测方法以及克服其耐药性的研究策略，对于诊断此类食源性致病菌并控制其生物被膜的形成至关重要。基于传统培养的金黄色葡萄球菌检测方法虽可靠，但仍存在操作繁琐、耗时且不适用于现场应用等不足。快速检测中免疫学分析方法虽能提供较为快速的检测方案，但其灵敏度和稳定性易受抗体性能影响；与检测挑战并存的是由抗生素滥用加剧的细菌耐药性问题，细菌生物被膜的形成显著推动了耐药性的提升，由于现有抗菌剂存在耐药性及安全性等局限，迫切需要开发新型抗生物被膜策略。

3、核酸适配体（aptamer）是基于体外筛选体系——selex（systematic evolutionof ligands by exponential enrichment）筛选体系中富集到对靶标具有强结合能力的dna或rna序列，其具有易修饰、可化学合成、良好的批间一致性等优势，已广泛应用于生物传感与分析检测、药物靶向递送与控释体系构建、环境与公共卫生监测、医学治疗与辅助诊断以及抗毒力与干预策略研发等应用研究方向。目前已存在的selex筛选技术得到的适配体尽管表现出出色的亲和力与特异性，但在实际应用中的稳定性仍不尽人意，且筛选仍需考虑富集效率、筛选周期、非特异性吸附影响。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供靶向金黄色葡萄球菌蛋白a适配体及其筛选方法和应用。

2、本发明旨在利用peg进行金黄色葡萄球菌蛋白a（spa）特异性适配体筛选，同时结合计算机辅助筛选技术，获得兼具亲和力、特异性、稳定性为一体的适配体序列，并以此构建金黄色葡萄球菌适配体试纸条进行金黄色葡萄球菌的快速检测方法，同时探究适配体对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的干预潜力。具体研究内容如下：

3、基于水凝胶筛选spa适配体并结合机器辅助筛选：spa是金黄色葡萄球菌独有的毒力因子，在金黄色葡萄球菌免疫逃逸过程中发挥重要作用，也是形成生物被膜的关键因子。研究利用peg水凝胶的三维网状特性与细胞模拟性，将其作为适配体筛选生物容器，通过脱水缩合反应将spa固定于peg水凝胶内部进行适配体筛选，随后将筛选结果进行分子模拟与分子动力学的二次筛选，大大提升了适配体的动态稳定性稳动态定性。利用上述方法与手段，快速筛选出靶向spa的高亲和力、强特异性、动态稳定性的适配体序列，为后续实验奠定了研究基础。

4、基于筛选适配体的金黄色葡萄球菌生物被膜抑制研究：利用最优适配体进行金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制与解离研究，同时探究适配体抑制生物被膜形成机理，测量金黄色葡萄球菌理化性质的变化，观察生物被膜eps含量改变程度，并利用分子生物学技术研究在环境胁迫作用下，金黄色葡萄球菌spa蛋白表达变化。为金黄色葡萄球菌生物被膜抑制研究提供新策略，同时形成成熟的可面向食品加工场景的生物被膜抑制研究新方案。

5、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

6、第一方面，本发明提供了一种结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体，所述适配体的核苷酸序列包括x7、x26、x28、x32、x37、x39、x50中的至少一种；所述核苷酸序列依次为seq idno: 1-7所示。

7、第二方面，本发明提供了上述的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体的筛选方法，包括以下步骤：

8、利用聚乙二醇水凝胶作为三维生物筛选容器，在固定上金黄色葡萄球菌蛋白a后加入适配体随机文库进行富集筛选；

9、筛选完成后，对最终洗脱得到的候选适配体进行pcr扩增，再进行高通量测序；

10、将高通量测序得到的结果从热力学与二级结构层面进行平行评估；

11、依据序列相似性构建系统进化树并划分为多个家族，随后从每个家族中选择预测g最低的候选适配体进行亲和力与特异性测定。

12、第三方面，本发明提供了上述的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体或上述筛选方法得到的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体在制备靶向金黄色葡萄球菌蛋白a药物和/或检测金黄色葡萄球菌蛋白a产品中的应用。

13、所述药物为菌膜抑制药物。所述菌包括金黄色葡萄球菌。

14、第四方面，本发明提供了一种产品，包括上述的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体或上述筛选方法得到的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体；

15、所述产品包括但不限于试剂盒、检测芯片、探针、层析检测装置中的任意一种或多种。

16、第五方面，本发明提供了一种抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的方法，包括如下步骤：采用上述的核酸适配体、和/或，上述筛选方法得到的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体、和/或，上述的产品对待测样本进行检测。

17、第六方面，本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：上述的核酸适配体、和/或，上述筛选方法得到的结合金黄色葡萄球菌蛋白a的适配体、和/或，上述的产品对待测样本进行检测。

18、上述技术方案中的一个或一些技术方案具有如下优点或有益效果：

19、本发明的主要工作是利用peg水凝胶快速筛选spa的适配体，对候选适配体结合分子动力学进行二次筛选，同时探究了适配体抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的机制。主要研究结论如下：

20、1、基于peg聚乙二醇水凝胶的三维空间网状结构与细胞模拟性，在4℃条件下进行金黄色葡萄球菌spa蛋白的适配体快速筛选，同时结合分子动力学二次筛选，在七条候选适配体中获得了实际性能最佳的适配体x7、x32，亲和力分别为17.75±10.11 nm与31.07±7.96 nm，并在分子层面表现出了较强的结合稳定性，为后续研究奠定了坚实基础。

21、2、基于本发明筛选的性能最佳适配体x32，进行金黄色葡萄球菌生物被膜抑制研究，在最优条件下，适配体x32对生物被膜抑制率可达40%，对成熟生物被膜的解离率可达56.46%，降低了金黄色葡萄球菌的表面疏水性及黏附能力，同时影响了胞外多糖的产生，适配体处理后的金黄色葡萄球菌spa位点被遮蔽无法正常发挥其黏附与生物被膜分泌功能，细菌在感应到环境压力后，特异性表达出了对

spa的代偿性应答，但细菌

sec依赖性蛋白分泌通路及

srta介导的蛋白细胞壁锚定系统表达能力下降，限制了spa的输出与锚定，导致无法在细菌表面形成有效功能的spa蛋白，从而有效抑制了生物被膜的形成。