一种苹果蠹蛾几丁质酶基因CpCht10的dsRNA及其应用

本发明属于农业生物技术和害虫生物防治，具体涉及一种苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna及其应用。

背景技术：

1、苹果蠹蛾（cydia pomonella）是危害苹果、梨及其他果树果实的重要蛀果害虫。幼虫蛀入果实后取食，具有隐蔽性强、药剂难以直接接触等特点，易造成落果、虫果和商品价值下降。现有防治措施主要为化学药剂防治。长期或不合理使用化学药剂可能带来抗药性、农药残留和非靶标生物风险，因此需要开发具有较强靶标特异性的新型绿色防控技术。

2、rna干扰（rna interference，rnai）是由双链rna介导的序列特异性基因沉默过程。与靶基因序列互补的dsrna进入昆虫体内后，可被加工形成小干扰rna并引导靶mrna降解或抑制其翻译，从而降低靶基因表达。靶基因的选择以及有效dsrna片段的筛选，是rnai防治害虫能否获得稳定效果的关键。

3、几丁质是昆虫表皮、气管和围食膜等结构的重要组成成分。几丁质酶参与几丁质的降解和更新，与昆虫蜕皮、生长发育及组织重塑密切相关。因此，几丁质酶基因可作为害虫rna干扰防治的候选靶标。且现有技术尚缺少针对苹果蠹蛾cpcht10基因的特定rna干扰片段、配套制备引物及应用方案。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna及其应用，该dsrna可使苹果蠹蛾无法化蛹或畸形羽化死亡，为苹果蠹蛾绿色防控提供新的分子靶标，有望减少农药的大量使用，保护环境，降低生产成本，具有广阔的市场应用前景。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna，其特征在于，所述苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的编码区核苷酸序列如seq id no:1所示；所述dsrna的核苷酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明还提供了上述苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna的应用，所述dsrna用于防治苹果蠹蛾。

4、优选地，所述dsrna的浓度为5μg/μl。

5、本发明合成上述苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna的方法为：

6、s1、提取苹果蠹蛾5龄幼虫总rna并反转录为cdna；

7、s2、以所述cdna为模板，分别利用上游引物t7l和下游引物10r、上游引物10l和下游引物t7r进行pcr扩增，得到扩增产物a和扩增产物b；

8、所述上游引物10l的核苷酸序列如seq id no:5所示；所述下游引物10r的核苷酸序列如seq id no:6所示；所述上游引物t7l的核苷酸序列如seq id no:7所示；所述下游引物t7r的核苷酸序列如seq id no:8所示；

9、s3、将s2中得到的扩增产物a和扩增产物b混合作为模板，体外转录合成dsrna。

10、优选地，s2中所述pcr扩增的反应体系为：cdna1μl、10μm上游引物0.5μl、10μm下游引物0.5μl、2×taq pcr master mix ii 10μl、ddh2o补足至20μl；所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保温。

11、本发明与现有技术相比具有以下优点：

12、1、本发明根据苹果蠹蛾几丁质酶10基因合成dsrna，为害虫苹果蠹蛾的生物学防治提供了一种新的方法，有望减少农药的大量使用，保护环境，降低生产成本，提高经济收益，具有市场应用前景。

13、2、本发明以苹果蠹蛾蜕皮过程中关键的几丁质酶基因为rna干扰靶标，能够特异性干扰其正常生长发育、蜕皮过程及存活；由于dsrna具有序列特异性，可显著提高对靶标害虫的选择性，从而为苹果蠹蛾的绿色精准防控提供新的分子靶标。

14、3、本发明具有靶标明确、制备方法简单、重复性良好等优点，可为cpcht10 dsrna的批量制备以及后续rnai生物农药的开发和应用奠定技术基础。

15、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

1.一种苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna，其特征在于，所述苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的编码区核苷酸序列如seq id no:1所示；所述dsrna的核苷酸序列如seq idno:2所示。

2.一种如权利要求1所述的苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna的应用，其特征在于，所述dsrna用于防治苹果蠹蛾。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述dsrna的浓度为5μg/μl。

4.一种合成如权利要求1所述的苹果蠹蛾几丁质酶基因cpcht10的dsrna的方法，其特征在于，该方法为：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，s2中所述pcr扩增的反应体系为：cdna 1μl、10μm上游引物0.5μl、10μm下游引物0.5μl、2×taq pcr master mix ii 10μl、ddh2o补足至20μl；所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保温。