OsOR突变蛋白OsORF160S及其编码基因与应用

本发明属于植物基因工程和作物分子设计育种，具体涉及一种osor突变蛋白osorf160s及其编码基因与应用。

背景技术：

1、水稻是我国重要粮食作物之一。随着居民膳食结构改善和功能食品需求增加，稻米营养品质改良已成为水稻育种的重要方向。黑稻因富含花青素、多酚等活性成分，具有较高的营养价值和开发潜力。然而，黑稻籽粒中维生素a原类胡萝卜素，尤其是β-胡萝卜素含量仍有进一步提升空间。因此，在黑稻遗传背景下提高类胡萝卜素积累，是培育高营养品质黑稻新种质的重要技术方向。

2、类胡萝卜素是植物中重要的脂溶性色素和营养物质，β-胡萝卜素可作为维生素a原，对改善膳食营养具有重要意义。植物orange/or基因被认为与类胡萝卜素积累、质体发育及色素代谢调控有关，是作物类胡萝卜素强化育种的重要候选基因。已有研究多集中于or基因的过表达、自然变异或少数特定位点突变，但针对黑稻osor基因编码区进行系统性饱和碱基编辑并筛选能够稳定提高黑稻叶片和籽粒类胡萝卜素含量的新型等位突变位点，现有技术仍较少。

3、传统转基因过表达方式虽然可以改变目标基因表达水平，但通常存在外源基因持续表达、插入位点不确定、育种应用受限等问题。crispr/cas介导的碱基编辑技术能够在不造成dna双链断裂或大片段插入缺失的情况下，实现目标基因单碱基水平的精准替换。其中，腺嘌呤碱基编辑器abe可实现a>t到g>c的精准替换，胞嘧啶碱基编辑器cbe可在目标位点实现c>g到t>a的精准替换，适合创制编码区氨基酸点突变材料。然而，不同靶序列、不同编辑窗口及不同氨基酸位点对osor功能和类胡萝卜素积累的影响具有较强不可预测性，无法仅凭序列设计直接判断哪些突变位点能够引起愈伤组织橙色表型并进一步提高黑稻籽粒类胡萝卜素含量。

4、因此，亟需建立一种针对黑稻osor基因编码区的精准碱基编辑和功能突变筛选方法，获得能够提高黑稻叶片和籽粒类胡萝卜素含量的新osor点突变材料，为黑稻营养品质改良和分子设计育种提供新的基因资源和技术方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高黑稻类胡萝卜素含量的osor突变蛋白，编码该突变蛋白的核酸分子，以及利用腺嘌呤碱基编辑系统对黑稻osor基因编码区特定位点进行精准编辑，创制可提高黑稻叶片和籽粒中类胡萝卜素含量的osor等位突变材料的方法。

2、第一方面，本发明提供一种osor突变蛋白，其氨基酸序列如seq id no:4所示，为野生型osor蛋白第160位氨基酸由苯丙氨酸替换为丝氨酸的变体；所述野生型osor蛋白的氨基酸序列如seq id no:3所示。

3、所述osor突变蛋白可通过化学合成法或基因工程合成法获得。

4、第二方面，本发明提供一种核酸分子，其编码所述osor突变蛋白。

5、所述核酸分子可以是脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, dna）或核糖核酸（ribonucleic acid, rna）。

6、所述核酸分子可以通过化学基因合成技术从头合成，也可以通过crispr-cas碱基编辑技术‌在水稻基因组上原位生成。

7、在一些实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:2所示；所述核酸分子相对于野生型osor基因的编码序列，在第479位核苷酸发生t>c突变；所述野生型osor基因的编码序列如seq id no:1所示。

8、第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的表达盒、载体、宿主细胞或离体培养的愈伤组织。

9、所述载体可以是克隆质粒‌，包含多克隆位点、基础复制起点和筛选标记，用于外源dna片段的扩增与保存。所述载体也可以是表达质粒，包含强启动子和核糖体结合位点，用于在宿主中表达重组蛋白。

10、所述宿主细胞可以是克隆宿主菌株‌，如大肠杆菌（escherichia coli）dh5α，用于质粒的扩增与保存。所述宿主细胞也可以是植物表达菌株，如根癌农杆菌（agrobacteriumtumefaciens）eha105，用于介导t-dna向植物基因组转移，完成植物转基因操作。

11、所述离体培养的愈伤组织可以是水稻的胚性愈伤组织。

12、第四方面，本发明提供一种获得类胡萝卜素含量提高的黑稻的方法，所述方法包括对黑稻受体材料的osor基因编码区的靶序列进行腺嘌呤碱基编辑，使编辑后的osor基因表达所述osor突变蛋白，获得类胡萝卜素含量提高的转基因黑稻；所述osor基因的编码序列如seq id no:1所示；所述靶序列位于osor基因的反义链上，与seq id no:1所示核苷酸序列的第466位至第485位核苷酸对应。‌

13、上述方法中，可使用crispr-cas腺嘌呤碱基编辑器对所述靶序列进行腺嘌呤碱基编辑，使所述osor基因的编码序列的第479位核苷酸发生t>c突变。

14、crispr-cas腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, abe）无需切断dna双链，通过工程化改造的腺嘌呤脱氨酶，将目标位点的腺嘌呤（a）脱氨转化为肌苷（i），经细胞自身修复机制最终实现‌a-t碱基对到g-c碱基对的精准转换。

15、上述方法中，可通过向所述黑稻受体材料中导入靶向所述靶序列的单链向导rna（single guide rna, sgrna）的编码基因以及腺嘌呤脱氨酶与cas9切口酶（cas9 nickase,ncas9）融合蛋白的编码基因以实现所述靶序列的腺嘌呤碱基编辑。‌

16、上述方法中，与所述黑稻受体材料相比，所述转基因黑稻的叶片和籽粒中的β-胡萝卜素含量提高。

17、上述方法中，所述黑稻受体材料可以是任何适合的黑稻品种或品系，优选遗传特征优良的黑稻品种，如垦庆黑粳2号。

18、第五方面，由任一所述的方法获得的类胡萝卜素含量提高的转基因黑稻也属于本发明的范围。

19、第六方面，所述osor突变蛋白或编码所述osor突变蛋白的所述核酸分子在提高黑稻类胡萝卜素含量或黑稻分子设计育种中的应用也属于本发明的范围。

20、本发明的有益效果：

21、本技术的发明人以黑稻品种垦庆黑粳2号为受体材料，针对黑稻osor基因编码区设计了64个候选靶序列，并分别构建abe碱基编辑载体，共获得64个osor编码区碱基编辑载体。通过农杆菌介导的遗传转化，将上述64个编辑载体分别导入垦庆黑粳2号愈伤组织中，经抗性筛选、颜色表型观察、分化再生和分子鉴定，最终仅获得一个能够编辑osor基因并使抗性愈伤组织呈橙色的有效编辑载体（abe41）。作为对比例，其他63个编辑载体虽采用了相同的遗传转化和筛选方法，但未观察到稳定橙色愈伤表型，或未获得目标osor有效编辑材料。

22、abe41载体表达的腺嘌呤碱基编辑器能够靶向黑稻osor基因编码区的靶序列5′-ggcaagaatggaatgaatga-3′并产生特定位点突变，使osor基因的第479位核苷酸由t替换为c，导致osor蛋白第160位氨基酸由苯丙氨酸替换为丝氨酸（osorf160s）。与野生型垦庆黑粳2号相比，osorf160s突变材料的叶片和籽粒中类胡萝卜素含量显著提高，其中β-胡萝卜素含量分别提高至1.7倍和2.9倍（图5和图6）。该osorf160s突变材料可用于黑稻营养强化育种。

23、本发明提供的osor突变蛋白以及编码所述osor突变蛋白的核酸分子在提高黑稻叶片和籽粒类胡萝卜素含量、创制高营养品质黑稻种质、黑稻分子设计育种中具有重要的应用价值。

24、与传统的过表达osor基因相比，本发明提供的方法通过在黑稻内源osor基因编码区创制精准点突变，能够获得稳定遗传的新功能等位变异。该方法可直接在优良黑稻品种（如垦庆黑粳2号）背景中进行编辑，获得的突变材料具有较好的育种应用基础。