敲除PEP4、BAR1和PRB1基因在降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白降解中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及敲除pep4、bar1和prb1基因在降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白降解中的应用。

背景技术：

1、乳铁蛋白(lactoferrin，lf)为一种多功能蛋白，具有铁结合/转移、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗炎、抗癌等特性，从而具有调节细胞生长，清除有害的自由基并抑制几种有毒化合物形成的功能。这些功能性质密切依赖于人乳铁蛋白的结构完整性，特别是其高阶构象。乳铁蛋白还具有调节脂质代谢的能力，这不仅可以更好地调节饱腹感机制，还有助于对抗脂肪组织积累的趋势。因此，乳铁蛋白被认为是一种新的抗菌、抗癌的药物。目前，乳铁蛋白在许多商品中皆有添加，如婴幼儿配方奶粉、营养补充剂等。同时，乳铁蛋白由于具备抗氧化活性，也常作为化妆品中重要添加组分之一。随着人们对健康的关注，越发激起了科研工作者对乳铁蛋白的功能活性研究兴趣。

2、目前，获取乳铁蛋白的最直接的方法是从牛乳中分离提取，但是牛乳中的乳铁蛋白含量较低。同时，人体消化吸收异源蛋白可能带来一定的负面影响，如过敏反应。而科研工作者们为了解决这类问题，采用了基因工程方式构建工程菌株，进而发酵获取大量的乳铁蛋白。当前用于生产乳铁蛋白的宿主细胞包括：大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和植物细胞。大肠杆菌作为原核模式生物，具有营养要求低，易生长，周期短的优点，但是其没有成型的细胞器和完整的糖基化修饰系统，因此无法产生具有生物活性的目的蛋白，而哺乳动物细胞和植物细胞容易污染、生长环境要求严格、生长周期长等因素不适宜作为大批量生产乳铁蛋白的基底细胞。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，缓解乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中的降解问题，本发明提供了一种通过敲除pep4、bar1和prb1基因的方法，从而达到降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白降解的目的。

2、第一方面，本发明要求保护抑制pep4蛋白、bar1蛋白和prb1蛋白表达在如下任一中的应用：

3、(a1)降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白的降解；

4、(a2)降低马克斯克鲁维酵母的发酵上清液对乳铁蛋白的降解。

5、第二方面，本发明要求保护能够使马克斯克鲁维酵母中pep4蛋白、bar1蛋白和prb1蛋白的表达量降低的物质在如下任一中的应用：

6、(a1)降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白的降解；

7、(a2)降低马克斯克鲁维酵母的发酵上清液对乳铁蛋白的降解。

8、其中，所述物质可为靶向所述pep4蛋白、所述bar1蛋白和所述prb1蛋白的编码基因的shrna或所述shrna的化学修饰物、靶向所述pep4蛋白、所述bar1蛋白和所述prb1蛋白的编码基因的sirna或所述sirna的化学修饰物、能够表达所述shrna或所述sirna的表达载体或重组微生物、靶向所述pep4蛋白、所述bar1蛋白和所述prb1蛋白的编码基因的基因编辑工具(如crispr/cas技术、talen技术等)等。

9、在本发明的一个实施案例中，所述物质包括(或为)靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中pep4蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具1，靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中bar1蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具2，和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中prb1蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具3。

10、进一步地，所述crispr/cas9编辑工具1的靶序列如seq id no.5所示；所述crispr/cas9编辑工具2的靶序列如seq id no.10所示；所述crispr/cas9编辑工具3的靶序列如seq idno.15所示。

11、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具1具体包括重组载体1和同源重组片段1；所述重组载体1能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中pep4蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段1自5’端到3’端依次由上游同源臂1和下游同源臂1组成。在所述重组载体1中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为cccacaagaaacattctcca(seq id no.5)。所述上游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述下游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.4所示。

12、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具2具体包括重组载体2和同源重组片段2；所述重组载体2能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中bar1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段2自5’端到3’端依次由上游同源臂2和下游同源臂2组成。在所述重组载体2中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为agtttgccacctctacgtca(seq id no.10)。所述上游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述下游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

13、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具3具体包括重组载体3和同源重组片段3；所述重组载体3能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中prb1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段3自5’端到3’端依次由上游同源臂3和下游同源臂3组成。在所述重组载体3中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为tacgacgacgatgccggtaa(seq id no.15)。所述上游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述下游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.14所示。

14、第三方面，本发明要求保护一种降低马克斯克鲁维酵母或其发酵上清液对乳铁蛋白降解能力的方法。

15、本发明要求保护的降低马克斯克鲁维酵母或其发酵上清液对乳铁蛋白降解能力的方法，可包括如下步骤：抑制马克斯克鲁维酵母受体菌中的pep4蛋白、bar1蛋白和prb1蛋白的编码基因的表达，从而实现降低马克斯克鲁维酵母或其发酵上清液对乳铁蛋白的降解能力。

16、在所述方法中，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述pep4蛋白的编码基因的表达可通过crispr/cas9基因编辑技术实现。抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述bar1蛋白的编码基因的表达通过crispr/cas9基因编辑技术实现。抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述prb1蛋白的编码基因的表达通过crispr/cas9基因编辑技术实现。

17、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述pep4蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具1实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具1的靶序列如seq id no.5所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具1具体包括重组载体1和同源重组片段1；所述重组载体1能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中pep4蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段1自5’端到3’端依次由上游同源臂1和下游同源臂1组成。更进一步地，在所述重组载体1中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为cccacaagaaacattctcca(seqid no.5)。更进一步地，所述上游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述下游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.4所示。

18、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述bar1蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具2实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具2的靶序列如seq id no.10所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具2具体包括重组载体2和同源重组片段2；所述重组载体2能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中bar1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段2自5’端到3’端依次由上游同源臂2和下游同源臂2组成。更进一步地，在所述重组载体2中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为agtttgccacctctacgtca(seqid no.10)。更进一步地，所述上游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述下游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

19、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述prb1蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具3实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具3的靶序列如seq id no.15所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具3具体包括重组载体3和同源重组片段3；所述重组载体3能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中prb1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段3自5’端到3’端依次由上游同源臂3和下游同源臂3组成。更进一步地，在所述重组载体3中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为tacgacgacgatgccggtaa(seqid no.15)。更进一步地，所述上游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述下游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.14所示。

20、第四方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的方法在提高马克斯克鲁维酵母分泌表达乳铁蛋白的产量中的应用；

21、进一步地，在所述应用中，包括向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入乳铁蛋白的编码基因，使其在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的步骤。

22、第五方面，本发明要求保护一种构建对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌的方法。

23、本发明要求保护的构建对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌的方法，可包括前文第三方面中所述的步骤。

24、第六方面，本发明要求保护一种对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌。

25、本发明要求保护的对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌是采用前文第五方面中所述方法构建得到的。

26、第七方面，本发明要求保护如下任一应用：

27、(c1)前文第六方面中所述的马克斯克鲁维酵母重组菌在制备复配制剂中的应用；所述复配制剂中含有：a1)所述马克斯克鲁维酵母重组菌和/或其发酵产物(发酵上清液)；和，a2)乳铁蛋白；

28、(c2)前文第六方面中所述的马克斯克鲁维酵母重组菌和乳铁蛋白在制备复配制剂中的应用；所述复配制剂中含有：a1)所述马克斯克鲁维酵母重组菌和/或其发酵产物(发酵上清液)；和，a2)乳铁蛋白。

29、第八方面，本发明要求保护一种复配制剂。

30、本发明要求保护的复配制剂含有：a1)前文第六方面中所述的马克斯克鲁维酵母重组菌和/或其发酵产物(发酵上清液)；和，a2)乳铁蛋白。

31、在上述各相关方面中，所述pep4蛋白可为如下任一所示蛋白质：

32、(d1)氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质；

33、(d2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

34、(d3)与(d1)-(d2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

35、(d4)在(d1)-(d3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

36、在上述各相关方面中，所述bar1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

37、(e1)氨基酸序列为seq id no.6的蛋白质；

38、(e2)将seq id no.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

39、(e3)与(e1)-(e2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

40、(e4)在(e1)-(e3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

41、在上述各相关方面中，所述prb1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

42、(f1)氨基酸序列为seq id no.11的蛋白质；

43、(f2)将seq id no.11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

44、(f3)与(f1)-(f2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

45、(f4)在(f1)-(f3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

46、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

47、所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

48、在上述各相关方面中，所述pep4蛋白的编码基因可为如下任一所示dna分子：

49、(g1)seq id no.2所示的dna分子；

50、(g2)在严格条件下与(g1)限定的dna分子杂交且编码所述pep4蛋白的dna分子；

51、(g3)与(g1)-(g2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述pep4蛋白的dna分子。

52、在上述各相关方面中，所述bar1蛋白的编码基因为如下任一所示dna分子：

53、(h1)seq id no.7所示的dna分子；

54、(h2)在严格条件下与(h1)限定的dna分子杂交且编码所述bar1蛋白的dna分子；

55、(h3)与(h1)-(h2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述bar1蛋白的dna分子。

56、在上述各相关方面中，所述prb1蛋白的编码基因可为如下任一所示dna分子：

57、(i1)seq id no.12所示的dna分子；

58、(i2)在严格条件下与(i1)限定的dna分子杂交且编码所述prb1蛋白的dna分子；

59、(i3)与(i1)-(i2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述prb1蛋白的dna分子。

60、上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mna3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

61、上述基因中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastn作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existencecost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

62、上述基因中，所述95％以上的同一性可为至少96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

63、在上述各相关方面中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为ura3基因缺失的马克斯克鲁维酵母。因生产要求不得引入抗性筛选标记，故敲除基因组ura3基因。

64、在本发明的一个实施案例中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为敲除了马克斯克鲁维酵母cs-01基因组中ura3基因后所得；所述马克斯克鲁维酵母cs-01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为cgmcc no.30573。

65、实验证明，pep4蛋白、bar1蛋白和prb1蛋白的编码基因在酵母细胞中被敲除后可导致乳铁蛋白降解量下降，完整蛋白量显著提高。通过摇瓶发酵菌株，获取上清，发现敲除pep4蛋白、bar1蛋白和prb1蛋白的编码基因后明显缓解了乳铁蛋白的降解情况。本发明对于提高乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达产量具有重要意义。

66、保藏说明

67、分类命名：马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)；

68、参椐的生物材料：cs-01；

69、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

70、保藏机构简称：cgmcc；

71、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

72、保藏日期：2024年5月9日；

73、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.30573。