鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于动物分子遗传学领域，特别涉及一种鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记引物组、试剂盒、应用及鉴别方法。

背景技术：

1、卷口鱼是珠江流域特有种类，为珠江主流西江的四大名鱼之一，因其肉质嫩滑鲜美而驰名，具有较高的经济价值。在过去数十年水利工程建设、过度捕捞及水环境污染的影响下，其种群持续受到外部环境威胁，卷口鱼野生资源呈现出显著的衰退趋势，被列为极危物种，其野生资源亟待保护。

2、在卷口鱼遗传多样性研究方面，现有技术主要采用随机扩增多态性dna标记和线粒体细胞色素b基因序列分析等方法。然而，随机扩增多态性dna标记存在重复性差、信息量有限的缺陷；线粒体标记虽可用于系统发育分析，但无法满足个体间亲缘关系鉴定的需求。

3、微卫星标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等优点，已被广泛应用于鱼类的亲子鉴定、个体识别及遗传多样性评估。因此，开发一套多态性高、稳定性好的卷口鱼特异性微卫星引物，并建立基于微卫星标记的亲缘关系鉴定体系，对卷口鱼的种质资源保护和遗传育种具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本申请提供了一种鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记的引物组、试剂盒、应用及鉴别方法，实现低成本、高效率、标准化的大规模卷口鱼亲子鉴定与系谱管理。针对卷口鱼野生资源急剧衰退的现状，提供精准的遗传管理工具——可鉴别人工繁殖亲本的繁殖贡献、监测野生种群的遗传多样性，为种质资源保护提供关键技术支撑。

2、本发明采用的具体方案为：一种鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记的引物组，所述引物组由以下十对引物组成：

3、（1）序列如seq id no.1和2所示的引物对；

4、（2）序列如seq id no.3和4所示的引物对；

5、（3）序列如seq id no.5和6所示的引物对；

6、（4）序列如seq id no.7和8所示的引物对；

7、（5）序列如seq id no.9和10所示的引物对；

8、（6）序列如seq id no.11和12所示的引物对；

9、（7）序列如seq id no.13和14所示的引物对；

10、（8）序列如seq id no.15和16所示的引物对；

11、（9）序列如seq id no.17和18所示的引物对；

12、（10）序列如seq id no.19和20所示的引物对。

13、一种试剂盒，包括所述的鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记的引物组。

14、以及所述的引物组或所述的试剂盒在鉴别卷口鱼的亲缘关系中的应用。

15、一种采用微卫星标记技术鉴别卷口鱼亲缘关系的方法，包括以下步骤：

16、s1、合成所述的引物组；分别提取同一种群的卷口鱼基因组dna；

17、s2、以s1中提取到的卷口鱼基因组dna为dna模板，并采用所合成的引物组进行pcr扩增，得到扩增产物；

18、s3、将所述扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和核酸染料染色，得到染色结果；

19、s4、基于所述染色结果，采用遗传分析软件绘制upgma聚类分析图以得到聚类结果，并根据所述聚类结果鉴定同一种群内不同个体的亲缘关系。

20、而且，pcr扩增的反应体系由25ul的2×san taq pcr mix、两对引物的上下游各1ul、1ul的dna模板和22ul的超纯水构成；

21、pcr扩增的反应程序为：

22、s1、在94℃条件下预变性5分钟；

23、s2、依次在94℃条件下变性45秒，56℃条件退火30秒，72℃条件延伸30秒，共32个循环；

24、s3、72℃条件下延伸8分钟，并在4℃条件下保存。

25、与现有技术相比，本技术方案的优势在于：

26、1.填补物种空白：此前卷口鱼尚无可用于亲缘关系鉴定的微卫星标记体系，本申请是针对卷口鱼首个专门开发的重复单元微卫星鉴定系统；2.遗传分辨率更高：本申请通过大规模全基因组数据挖掘，筛选出10个高多态性、稳定性强的微卫星位点，构建了适用于卷口鱼的专用微卫星体系，相较于现有技术中位点数量有限、多态性不足的问题，显著提高了遗传区分能力，能够实现个体级和家系级的精准识别；3.高稳定性与重复性：微卫星为共显性pcr标记，同一dna样本在不同时间、不同实验室扩增结果一致，比现有技术中的随机扩增多态性dna标记显著稳定。4.亲缘关系可量化：共显性标记可直接追踪等位基因在亲本与后代间的传递，支持亲缘系数计算和亲子鉴定，弥补了现有技术中的线粒体标记无法区分个体间亲缘关系的不足。5.操作简便、适用性广：基于常规pcr及聚丙烯酰胺凝胶电泳即可完成，无需昂贵设备或复杂算法，适合基层苗种场、中小型育种企业及野外资源调查使用。6.极危物种保护刚需：针对卷口鱼野生资源急剧衰退的现状，提供精准的遗传管理工具——可鉴别人工繁殖亲本的繁殖贡献、监测野生种群的遗传多样性，为种质资源保护提供关键技术支撑。

1.一种鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记的引物组，其特征在于，所述引物组由以下十对引物组成：

2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的鉴别卷口鱼亲缘关系的微卫星标记的引物组。

3.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在鉴别卷口鱼的亲缘关系中的应用。

4.一种采用微卫星标记技术鉴别卷口鱼亲缘关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种采用微卫星标记技术鉴别卷口鱼亲缘关系的方法，其特征在于：pcr扩增的反应体系由25ul的2×san taq pcr mix、两对引物的上下游各1ul、1ul的dna模板和22ul的超纯水构成；