一种表达IL-2/IL-2Rβ融合蛋白的CAR-T细胞及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种表达il-2/il-2rβ融合蛋白的car-t细胞及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、嵌合抗原受体t细胞（car-t）疗法在血液恶性肿瘤治疗中取得了显著成功，但在实体肿瘤中仍面临浸润能力差、细胞耗竭快、肿瘤微环境抑制等问题。传统car-t细胞通常来源于αβ t细胞，易引起移植物抗宿主病，且难以有效浸润实体肿瘤组织。γδt细胞具有天然免疫和适应性免疫双重特性，不依赖主要组织相容性复合体进行抗原识别，不会引发移植物抗宿主病，并具有天然的组织归巢能力，在实体肿瘤中表现出强抗肿瘤活性和低毒性，是car-t细胞治疗的理想平台。然而，水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白假型慢病毒依赖低密度脂蛋白受体入侵，而γδt细胞表面低密度脂蛋白受体表达量低，转导效率极低，需高病毒用量，成本高、插入突变风险大；car-γδt在无外源细胞因子时连续杀伤能力快速下降，持久性不足；在肿瘤微环境中，car-γδt细胞会经历功能衰竭和增殖能力下降。且传统car-t通过外源添加il-2来维持t细胞生长和存活，但全身给药il-2可导致严重细胞毒性，促进调节性t细胞增殖或加剧效应t细胞的终末分化和衰竭，同时外源性il-2易引起免疫排斥反应。

3、因此，寻找一种既能高效转导t细胞，又能使car-t细胞在不依赖外源il-2的条件下实现自我增殖与持久杀伤，是当前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供一种表达il-2/il-2rβ融合蛋白的car-t细胞及其应用。本发明将白细胞介素-2（il-2）与白细胞介素-2受体β链（il-2rβ）通过柔性连接肽（whitlow linker）和刚性连接肽（eaaak linker）串联，连接至表达载体后锚定于细胞膜表面，表达后，膜表面的il-2与il-2rβ通过自分泌机制相互结合，向细胞提供持续的il-2信号；同时结合狒狒内源性逆转录病毒的包膜糖蛋白（baev-gp）假型化慢病毒高效转导，使car-t细胞无需外源添加il-2即可具有自行维持增殖和持续杀伤的能力。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、本发明的第一方面提供了一种il-2/il-2rβ融合蛋白，所述il-2/il-2rβ融合蛋白为用间插接头融合至il-2rβ的n末端的il-2。

4、所述间插接头包括柔性连接肽和刚性连接肽。

5、其中，所述il-2的氨基酸序列如seq id no: 11所示，所述il-2rβ的氨基酸序列如seq id no: 14所示，所述柔性连接肽的氨基酸序列如seq id no: 12所示，所述刚性连接肽的氨基酸序列如seq id no: 13所示。

6、进一步地，il-2/il-2rβ融合蛋白从n末端至c末端依次包含il-2、柔性连接肽、刚性连接肽和il-2rβ；所述il-2的c末端连接所述柔性连接肽的n末端，所述柔性连接肽的c末端连接所述刚性连接肽的n末端，所述刚性连接肽的c末端连接所述il-2rβ的n末端。

7、本发明的第二方面提供了一种编码如第一方面所述的il-2/il-2rβ融合蛋白的核酸分子。

8、本发明的第三方面提供了一种包含如第二方面所述的核酸分子的表达载体，所述表达载体具有一个或多个调节区，用于表达如第一方面所述的il-2/il-2rβ融合蛋白。

9、进一步地，所述表达载体包括dna载体、rna载体、质粒、转座子载体、crispr/cas9载体或病毒载体。

10、进一步地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。

11、进一步地，所述慢病毒载体为baev-gp假型化慢病毒。

12、更进一步地，编码baev-gp假型化慢病毒的核苷酸序列如seq id no: 9所示。

13、本发明的第四方面提供了一种表达如第一方面所述的il-2/il-2rβ融合蛋白的car-γδt细胞。

14、进一步地，所述car-t细胞还表达靶向cd19、b7h3、fap、cd20、cd22、cd30、cd33、cd123、bcma、caix、cd44、cea、egp-2、egp-40、erb-b2，erb-b3，erb-b4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、gd2、gd3、her2、il-11ra、il-13r-a2、il1rap、ncam、ny-eso-1、flt3、kdr、ley、mage-a1、muc1、瘤胎、psca、psma、tag-72、vegf、ror1、c-met、糖脂f77、egfrviii、mage a3、5t4、wt1、kg2d配体、叶酸受体、vegf-r2、gpc3、wnt1、robo1、mesothelin的car。

15、本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的il-2/il-2rβ融合蛋白、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体或第四方面所述的car-t细胞。

16、进一步地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

17、本发明的第六方面提供了一种如第四方面所述的car-t细胞的制备方法，其包括将第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体导入到t细胞中。

18、本发明的第七方面提供了第一方面所述的il-2/il-2rβ融合蛋白在制备用于通过以下方法治疗肿瘤的药物中的用途，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的car-t细胞，所述car-t细胞表达如第一方面所述的il-2/il-2rβ融合蛋白。

19、进一步地，所述肿瘤包括cd19、b7h3、fap、cd20、cd22、cd30、cd33、cd123、bcma、caix、cd44、cea、egp-2、egp-40、erb-b2，erb-b3，erb-b4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、gd2、gd3、her2、il-11ra、il-13r-a2、il1rap、ncam、ny-eso-1、flt3、kdr、ley、mage-a1、muc1、瘤胎、psca、psma、tag-72、vegf、ror1、c-met、糖脂f77、egfrviii、mage a3、5t4、wt1、kg2d配体、叶酸受体、vegf-r2、gpc3、wnt1、robo1或mesothelin阳性肿瘤。

20、本发明的有益效果：

21、（1）本发明通过采用whitlow linker和eaaak linker串联连接il-2与il-2rβ的膜结合il-2/il-2rβ构象更接近天然结合构象，可以解决传统linker存在的稳定性或效率问题。其中，whitlow linker能更有效地促进膜融合蛋白（il-2及il-2rβ）两个结构域的正确折叠和空间构象，减少因空间位阻导致的蛋白错误折叠或聚集。eaaak linker（glu-ala-ala-ala-lys重复单元）则通过稳定的α-螺旋结构将il-2和il-2rβ两个功能域在空间上有效分开，形成稳定的“臂状”结构；通过以上两种连接肽的配合，使il-2/il-2rβ融合蛋白稳定锚定于t细胞膜表面并启动持续的自分泌il-2信号，从而在不依赖外源il-2的条件下实现car-t细胞的自我增殖与持久杀伤能力。此外，刚性螺旋结构比柔性序列更能抵抗蛋白酶的水解，因此膜绑定的il-2/il-2rβ复合体在t细胞表面能维持更长时间的功能完整性。

22、（2）本发明采用狒狒内源性逆转录病毒的包膜糖蛋白制备的baev-gp假型化慢病毒，能够特异性识别γδt细胞表面高表达的asct1/asct2受体，显著克服了传统vsv-g假型慢病毒因依赖低密度脂蛋白受体（ldl-r）而导致的转导效率低下的技术问题。

23、（3）本发明的实验表明，在低moi时，baev-gp假型慢病毒对γδt细胞的转导效率显著高于vsv-g假型慢病毒在moi高达50时的转导效率。同时，该baev-gp假型慢病毒载体系统对cd19-car、b7h3-car、fap-car等多种car结构均表现出优异的兼容性，为本发明car-γδt细胞平台的构建提供了可靠的技术保障。